[發明專利]一種純化脂肪細胞及其前體細胞的方法及其應用

在審

• 申請號: 202010748755.5
• 申請日: 2020-07-30
• 公開（公告）號: CN111893089A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 楊嘉
• 申請（專利權）人: 楊嘉
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;A61L27/38;A61L27/50;A61L27/60
• 代理公司: 云南凌云律師事務所 53207
• 代理人: 董建國

本發明涉及一種純化脂肪細胞及其前體細胞的方法，從人體或哺乳動物的脂肪組織塊中，通過紅細胞裂解液和DMEM F/12的混合溶液清洗后，采用組織消化液進行消化，離心、過濾處理等步驟后，可從微量脂肪組織中，高效分離獲得高純度和高活性的脂肪源前體細胞，分離獲得的脂肪源前體細胞培養液，具備較高濃度的不同類型的細胞營養因子，所獲得的脂肪源前體細胞及其產物可以用于組織修復。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種純化脂肪細胞及其前體細胞的方法及其用于組織修復的應用。

背景技術

當前脂肪源前體細胞的分離的方法，主要有剪碎消化法、剪碎貼壁培養法和抽吸法等方法。前述兩種方法都是取出脂肪組織后，破碎組織塊，進行細胞分離。抽吸法包括負壓吸引器抽吸、注射器抽吸；有相關研究表明，采集脂肪時剪碎法對脂肪細胞的損傷最輕，注射器法居中，負壓器吸脂法最重，負壓越大，脂肪細胞的損傷就越大。剪碎貼壁法，則通過細胞從組織塊中遷移出來分離，不能立即分離得到單個細胞，且受供者年齡，健康狀況等因素的影響，分離周期長。剪碎消化法，通過消化酶的作用，可以快速得到單個細胞；但是傳統的消化法，會影響到脂肪源前體細胞的活性和完整性，造成較低的細胞存活率，細胞得率小，無法滿足后續的臨床運用。

以上現有的技術方案均存在一點的弊端，無法快速分離得到優質且大量的脂肪源前體細胞，細胞不具備更高的增殖能力和細胞活性，無法滿足下游的臨床和研究需要，亟待發明一種實現高效分離且能獲得較高純度和活性的脂肪源前體細胞分離技術方案來解決上述技術問題。

發明內容

針對上述提到的問題，本發明提供一種純化脂肪細胞及其前體細胞的方法及其用于組織修復的應用。

具體技術方案是：一種純化脂肪細胞及其前體細胞的方法，包括如下步驟：

1）從人體或者哺乳類動物皮下獲取0.2cm³~5 cm³的脂肪組織塊，重懸于DMEM F/12中，放入4℃冰箱或者冰盒等待處理。

2）脂肪源前體細胞分離前，脂肪組織用75%酒精沖洗1s~30s，擦拭干凈外包裝。

3）在生物安全柜內進行操作，脂肪組織依次用生理鹽水沖洗至少3次。

4）棄干凈生理鹽水，將脂肪組織移至干凈培養皿中，加入1~5mL的紅細胞裂解液和DMEM F/12的混合溶液，清洗脂肪組織3遍，每遍5分鐘，并剪碎脂肪組織；在剪碎過程中可以使用剪刀、鑷子、刀片等盡量剪碎脂肪組織。

5）按照10倍的體積，使用紅細胞裂解液和DMEM F/12的混合液，重懸剪碎的脂肪組織，轉移到干凈的離心管中，取400g，離心10分鐘。

6)棄上清，收集下層組織沉淀，按照10倍的體積加入組織消化液，重懸組織，放至搖床消化0.5~12h，37℃，40~90rpm。

7）消化結束后，加入等體積預冷的DMEM F/12培養液到消化溶液中，使用移液管反復吹吸消化乳糜液10~30次。DMEM F/12培養液預冷的溫度為0℃至8℃。

8）取400g，離心10分鐘后棄上清，使用10倍沉淀體積的DMEMF/12培養液重懸沉淀組織，再次取400g，離心10分鐘。

9）重復上述步驟8）。

10）棄上清，使用10倍沉淀體積的DMEMF/12培養液重懸沉淀組織，使用40微米的濾膜過濾，使用預冷的DMEMF/12培養液洗滌濾網1~3次。

11）重懸混勻上述過濾液，使用10~20微米的濾膜再一次進行過濾，用預冷的DMEMF/12培養液洗滌濾網1~3次。DMEM F/12培養液預冷的溫度為0℃至8℃。