[發明專利]一種純化脂肪細胞及其前體細胞的方法及其應用

在審

• 申請號: 202010748755.5
• 申請日: 2020-07-30
• 公開（公告）號: CN111893089A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 楊嘉
• 申請（專利權）人: 楊嘉
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;A61L27/38;A61L27/50;A61L27/60
• 代理公司: 云南凌云律師事務所 53207
• 代理人: 董建國

1.一種純化脂肪細胞及其前體細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）從人體或者哺乳類動物皮下獲取0.2cm³~5 cm³的脂肪組織塊，重懸于DMEM F/12中，放入4℃冰箱或者冰盒等待處理；

2）脂肪源前體細胞分離前，脂肪組織用75%酒精沖洗1s~30s，擦拭干凈外包裝；

3）在生物安全柜內進行操作，脂肪組織依次用生理鹽水沖洗至少3次；

4）棄干凈生理鹽水，將脂肪組織移至干凈培養皿中，加入1~5mL的紅細胞裂解液和DMEMF/12的混合溶液，清洗脂肪組織3遍，每遍5分鐘，并剪碎脂肪組織；

5）按照10倍的體積，使用紅細胞裂解液和DMEM F/12的混合液，重懸剪碎的脂肪組織，轉移到干凈的離心管中，取400g，離心10分鐘；

6)棄上清，收集下層組織沉淀，按照10倍的體積加入組織消化液，重懸組織，放至搖床消化0.5~12h，37℃，40~90rpm；

7）消化結束后，加入等體積預冷的DMEM F/12培養液到消化溶液中，使用移液管反復吹吸消化乳糜液10~30次；

8）取400g，離心10分鐘后棄上清，使用10倍沉淀體積的DMEMF/12培養液重懸沉淀組織，再次取400g，離心10分鐘；

9）重復上述步驟8）；

10）棄上清，使用10倍沉淀體積的DMEMF/12培養液重懸沉淀組織，使用40微米的濾膜過濾，使用預冷的DMEMF/12培養液洗滌濾網1~3次；

11）重懸混勻上述過濾液，使用10~20微米的濾膜再一次進行過濾，用預冷的DMEMF/12培養液洗滌濾網1~3次；

12）取400g離心上述步驟11）的組織過濾液，3~10分鐘，收集離心后的沉淀物，使用細胞培養液吹散重懸細胞，使用0.04%臺盼藍染色5分鐘后計數細胞活率，細胞活率不低于80%；

13）所述步驟12）的細胞可直接用生理鹽水重懸使用，或者按傳統的方法進行凍存備用或者可培養擴增；細胞接種于3~6個T25培養瓶鋪板培養，培養條件為37℃，5%CO2的常規細胞培養條件，擴增培養的細胞，在P6代以內使用細胞。

2.根據權利要求1所述的一種純化脂肪細胞及其前體細胞的方法，其特征在于：所述步驟4）和步驟5）中的紅細胞裂解液和DMEM F/12混合比例為體積1：1。

3.根據權利要求1所述的一種純化脂肪細胞及其前體細胞的方法，其特征在于：所述步驟6）的組織消化液包括DMEM F/12 +1.5mg/mL透明質酸酶+1.5mg/mL膠原酶+ 0.03%胰酶。

4.根據權利要求1所述的一種純化脂肪細胞及其前體細胞的方法，其特征在于：所述步驟1）中的哺乳類動物包括鼠、猴、豬、牛。

5.一種利用如權利1-4所述的純化脂肪細胞及其前體細胞的方法所獲得的脂肪細胞及其前體細胞，其特征在于，該脂肪細胞及其前體細胞可用于組織修復。