[發明專利]一種研究雞生殖細胞自噬的方法

在審

• 申請號: 202010748580.8
• 申請日: 2020-07-30
• 公開（公告）號: CN111850082A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 左其生;丁穎;李碧春;姜景譯;袁霞;石祥;張明;張亞妮;孫紅艷
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N33/68
• 代理公司: 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222
• 代理人: 沈志海

一種研究雞生殖細胞自噬的方法，屬于生物技術領域。在生殖細胞中添加雷帕霉素激活細胞自噬，轉染不同MOI值的GFP?LC3慢病毒載體，在顯微鏡下觀察細胞生長狀態，排除MOI值過高導致細胞凋亡的分組。收集各組樣品，EdU檢測各組細胞的增殖效率，同時通過western?blot檢測游離的GFP蛋白和自噬標志蛋白LC3?Ⅰ（16 ku）與LC3?Ⅱ（14 ku）之間的轉化和比例及熒光顯微鏡定位LC3蛋白在細胞中的表達情況綜合評判該MOI值在雞生殖細胞中的適用性。本發明操作簡單，切實可行，探討GFP?LC3慢病毒載體在雞生殖細胞中的轉染條件是將為自噬在胚胎干細胞向原始生殖細胞的誘導分化中的作用研究奠定基礎。

技術領域

本發明涉及GFP-LC3慢病毒載體轉染雞生殖細胞確定最佳效果的MOI值，具體是一種研究雞生殖細胞自噬的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

自噬是一種在真核細胞內保守的降解過程，從單細胞的酵母到哺乳動物中都普遍存在。自噬通過降解細胞內受損的蛋白、細胞器、細胞質以及入侵的微生物等來維持機體的穩態。通過電鏡檢測自噬體及其相關結構是檢測自噬的金標準，但由于電鏡操作及數據分析專業性要求較高，目前的文獻報道中最常用的方法有Western blot檢測自噬標志蛋白LC3-Ⅰ與LC3-Ⅱ之間的轉化和比例變化，以及通過熒光顯微鏡觀察LC3點狀聚集物的形成，這些方法都可以監測自噬發生的程度。

利用GFP示蹤LC3蛋白來檢測自噬流是一種常見的經典的方法。當利用轉基因的方法，將GFP融合連接到LC3基因上后，當細胞自噬未發生時，GFP-LC3蛋白將隨機分布在細胞質中，而當細胞自噬發生時，GFP-LC3蛋白將作為雙層膜的主要組成部分，聚集在一起，在熒光顯微鏡下，可以看到聚集所形成的綠色點狀，然后，參與自噬體的構成和運輸。當自噬體運送到溶酶體后，LC3蛋白很快就被溶酶體降解，而GFP具有一定抵抗水解的能力，因此，也可以利用western-blot和熒光顯微鏡觀察檢測游離的GFP蛋白的方法，來觀測自噬體是否被溶酶體降解。

發明內容

慢病毒GFP-LC3載體轉染細胞是檢測自噬流是一種常見的經典的方法。但是該病毒載體在雞的生殖細胞中轉染的最佳MOI值尚未可知。MOI=（病毒滴度×病毒體積）/細胞數目。發明人一直致力于雞原始生殖細胞的研究，擁有成熟的分離細胞和轉染細胞技術，但不同載體在細胞中發揮的效果不同，若MOI值偏低，則會導致轉染效果不佳，影響對自噬水平的評價，達不到預期效果；若MOI值偏高，則會影響細胞增殖速率，導致細胞凋亡。因此有必要進行該發明，確定GFP-LC3慢病毒載體在生殖細胞中的最佳轉染MOI值，為研究自噬在胚胎干細胞向原始生殖細胞的作用研究奠定基礎。

本發明的技術方案如下：

首先在生殖細胞中添加雷帕霉素激活細胞自噬，轉染不同MOI值的GFP-LC3慢病毒載體，在顯微鏡下觀察細胞生長狀態，排除MOI值過高導致細胞凋亡的分組。收集各組樣品，EdU檢測各組細胞的增殖效率，同時通過western-blot檢測游離的GFP蛋白和自噬標志蛋白LC3-Ⅰ（16 ku）與LC3-Ⅱ（14 ku）之間的轉化和比例及熒光顯微鏡定位LC3蛋白在細胞中的表達情況綜合評判該MOI值在雞生殖細胞中的適用性。

本發明的有益效果如下：

本發明操作簡單，切實可行。發明人一直致力于雞的胚胎干細胞向原始生殖細胞分化的研究，具備成熟的細胞分離培養技術，具有該發明所需具備的設備及研究基礎。發明人前期對雞的胚胎干細胞向原始生殖細胞誘導過程中測序發現自噬信號通路被激活，自噬相關基因INS、VAC8、ATG7、ATG8表達上調，AMPK、ATG4表達下調。這啟發探討自噬在原始生殖細胞誘導分化中的作用。而探討GFP-LC3慢病毒載體在雞生殖細胞中的轉染條件是將為自噬在胚胎干細胞向原始生殖細胞的誘導分化中的作用研究奠定基礎。

具體實施方式

1.設置GFP-LC3慢病毒載體的MOI值梯度轉染生殖細胞