[發明專利]腸道微生物在診斷肌張力障礙癥中的應用

有效

• 申請號: 202010747066.2
• 申請日: 2020-07-30
• 公開（公告）號: CN112029844B
• 公開（公告）日: 2021-10-19
• 發明（設計）人: 胡永峰;馬凌燕;程敏;楊帆;金奇
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院病原生物學研究所
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/689;C12Q1/6869;C12Q1/04;G01N30/02;G16B50/10;G16B30/10;A61K45/00;A61P21/00;A23L33/10
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所(普通合伙) 11130
• 代理人: 王為

1.檢測腸道微生物表達水平的試劑在制備診斷肌張力障礙的試劑盒中的應用，其中所述腸道微生物包括：霍氏真桿菌(Eubacterium hallii)，卵形布勞特氏菌(Blautiaobeum)，長鏈多爾氏菌(Dorea longicatena)，普通擬桿菌(Bacteroides vulgatus)和四棘蝴蝶魚擬桿菌(Bacteroides_plebeius)。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，檢測腸道微生物表達水平的方法為16SrRNA基因組靶向擴增測序和宏基因組測序相結合的方法。

3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：

1)孤立性肌張力障礙病人腸道微生物組的16S rRNA基因組靶向擴增測序分析

(1)收集孤立性肌張力障礙病人及其家人新鮮排泄物，迅速凍存并進微生物組DNA提取，

(2)采用 Qiangen的QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit試劑盒進行微生物核酸提取，

(3)采用針對細菌16S rRNA基因V4區的特異性引物進行擴增，PCR片段回收純化，

(4)利用Illumina公司的Hiseq 2500進行高通量測序，

(5)測序數據的加工處理，包括原始數據的質量控制，凈化，去冗余，最終行到高質量的可用于后續生物信息學分析的序列數據，

(6)生物信息學分析，包括將不同樣本的數據標準化或歸一化為同一個測序深度的數據量，

(7)利用標準化數據對腸道菌群的alpha和beta多樣性分析比較，

2)孤立性肌張力障礙病人腸道微生物組的宏基因組測序分析

(1)收集孤立性肌張力障礙病人及其家人新鮮排泄物，迅速凍存并進微生物組DNA提取，

(2)采用試劑盒對微生物組DNA進行片段化處理后，直接進行鳥槍法隨機片段測序文庫構建，

(3)測序數據的加工處理，包括原始數據的質量控制，凈化，去冗余，

(4)測序數據分別得用現有的生物信息軟件進行處理、分析，最終確定微生物組的結構組成，

(5)利用BLASTP對序列數據與KEGG數據庫進行比對，對腸道微生物組的基因功能進行注釋，

(6)生物信息學分析，包括將不同樣本的數據標準化或歸一化為同一個測序深度的數據量，

(7)利用標準化數據對腸道菌群的alpha和beta多樣性分析比較，

3)孤立性肌張力障礙病人腸道微生物組的代謝組學分析

(1)血清樣本都在冰上解凍，量控制樣本用于估計代表分析過程中遇到的所有分析物的平均輪廓，

(2)用甲醇對血清樣本進行處理，然后，離心，

(3)用高效液相色譜-質譜對上清液進行代謝組學分析，樣品分析采用Waters ACQUITY超高性能液相色譜系統和W_aters Q-TOF微質量系統進行在正負電離兩種模式下進行分析，

(4)原始GC-MS數據的提取、對齊、反冗余后導出為包括變量、觀測值和峰值強度的一個峰值數據集文件，并進行進一步的標準化處理，

(5)文件導入到生物統計學軟件中，執行偏最小二乘回歸分析，

(6)差異代謝物與差異微生物組的斯皮爾曼相關性分析，挖掘腸道微生物組改變對病人血清代謝組的影響，從而進一步分析對神經遞質的改變。