[發明專利]靶向敲除TNFα基因的sgRNA和敲除TNFα基因的豬胚胎成纖維細胞系及其應用

有效

• 申請號: 202010745244.8
• 申請日: 2020-07-29
• 公開（公告）號: CN111944810B
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 張浩;付玉;張盼;張博;凌遙
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N5/10;C12N15/11;C12Q1/6888;C12Q1/02;A01K67/027;C12R1/91
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 錢云

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及靶向敲除TNFα基因的sgRNA和敲除TNFα基因的豬胚胎成纖維細胞系及其應用；本發明提供的TNFα基因敲除的sgRNA在TNFα基因上的靶點序列位于其第一外顯子上，靶點序列如SEQ ID NO：1所示。在將所述sgRNA構建至載體pX330后，將表達載體pX330?TNFα作為TNFα基因的打靶載體，轉染豬胚胎成纖維細胞，獲得TNFα基因敲除的豬胚胎成纖維細胞單克隆細胞株，得到的多種不同編輯類型的突變體均可造成移碼突變，編輯效率較高。本發明制備得到的豬胚胎成纖維細胞細胞系可作為體細胞核移植的供體，用于轉基因豬的制備，具有較大的應用研究價值。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及靶向敲除TNFα基因的sgRNA和敲除TNFα基因的豬胚胎成纖維細胞系及其應用。

背景技術

CRISPR-Cas系統是在大多數古生菌和多數細菌中存在的一種用于抵抗外源病毒或DNA入侵的獲得性免疫系統。II型RISPR-Cas9系統是目前改造最成功、應用最廣泛的，主要是通過一段短的RNA序列與DNA靶點序列按照堿基互補原則形成雙鏈后，結合Cas9蛋白在DNA靶位點誘導形成雙鏈斷裂損傷，損傷修復時可以在基因組靶位點引入特殊的基因突變。CRISPR-Cas9系統具有設計簡單，打靶效率高及能在靶位點形成多種突變的優點，目前已廣泛應用于基因功能及轉基因動物等的研究中。

腫瘤壞死因子TNFα(Tumor Necrosis Factor alpha)是一種促炎細胞因子，能參與正常炎癥反應和免疫反應。近年的研究發現TNFα還能通過作用于生長激素/胰島素樣生長因子軸，來抑制機體生長和導致肌肉蛋白降解，可能在肌肉發育方面起負調控作用。目前對TNFα基因的研究大部分是利用抑制劑發掘其在人和小鼠中的作用，對豬源TNFα功能研究鮮有報道，而且藥物阻斷的特異性和有效性的很難保障，不能很好的解釋基因功能，也存在一定的安全風險。

目前現有技術的抑制劑、沉默、敲低、干擾等方法特異性不強、沉默不徹底或者無法沉默TNFα基因表達，因此有必要研制一種能實現沉默徹底且能長期穩定體外培養的豬TNFα基因缺失細胞株，期望通過TNFα基因缺失成纖維細胞株制備轉基因豬，為免疫和炎癥反應的研究提供疾病模型，同時為深入挖掘TNFα基因在豬肌肉發育方面的調控作用研究提供基礎。

發明內容

為了至少解決現有技術存在的一種問題，本發明提供一種靶向敲除TNFα基因的sgRNA和敲除TNFα基因的豬胚胎成纖維細胞系及其應用。

第一方面，本發明提供一種靶向敲除TNFα基因的sgRNA，所述sgRNA靶點序列如SEQID NO：1所示。

本發明進一步提供編碼所述sgRNA的DNA分子。

本發明進一步提供含有所述sgRNA的生物材料，所述生物材料為載體、表達盒或轉基因細胞中的一種或多種。

例如，可以將所述sgRNA通過酶切連接至載體pX330上，具體方法為：

在TNFα基因的第一外顯子上的靶點序列(SEQ ID NO：1)的5'端加上BbsI的酶切位點caccg，構成序列SEQ ID NO：2，并人工合成其互補序列SEQ ID NO：3，將互補序列SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3退火所形成的雙鏈DNA分子，與經過BbsI酶切的pX330載體連接，從而構建表達載體pX330-TNFα。

第二方面，本發明提供一種敲除了TNFα基因的細胞系的構建方法，包括：

利用CRISPR-Cas9系統敲除所述細胞系的TNFα基因，所述CRISPR-Cas9系統使用的sgRNA靶點序列包括如SEQ ID NO：1所示的序列。

進一步地，所述利用CRISPR-Cas9系統敲除所述細胞系的TNFα基因中使用pX330載體。

進一步地，所述細胞系為豬胚胎成纖維細胞系。