[發明專利]一種人血漿中同型半胱氨酸的檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202010744203.7
• 申請日: 2020-07-29
• 公開（公告）號: CN111983057A
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 錢學慶;秦煒;吳小虎;賀笑非
• 申請（專利權）人: 上海潤達榕嘉生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/72;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/88
• 代理公司: 上海領洋專利代理事務所(普通合伙) 31292
• 代理人: 羅曉鵬

本發明提供了一種人血漿中同型半胱氨酸的檢測方法及試劑盒，步驟如下：在人血漿樣品中依次加入同型半胱氨酸同位素內標溶液、堿溶液和還原劑溶液后，混勻并在室溫下孵育，再加入蛋白沉淀劑溶液，震蕩離心后，取上清液進樣分析，用高效液相色譜?三重四極桿質譜儀進行檢測，本發明檢測方法前處理簡單、檢測成本低、特異性和抗基質干擾能力強，檢測LOQ較常規方法進一步降低。

技術領域

本發明涉及一種人血漿中同型半胱氨酸的檢測方法及試劑盒，屬于生物檢測領域。

技術背景

同型半胱氨酸Hcy又稱高半胱氨酸，是體內蛋氨酸循環和半胱氨酸代謝的中間產物，并能回轉成蛋氨酸，或經過轉硫途徑而回轉為半胱氨酸。正常血漿總同型半胱氨酸濃度一般在5-15μmol/L，平均濃度大約為10μmol/L。血漿總同型半胱氨酸濃度越高，患心腦血管疾病(如冠心病)，動脈粥樣硬化，腎功能障礙和糖尿病的風險越高。心腦血管疾病是心臟血管和腦血管疾病的統稱，泛指由于高脂血癥、血液粘稠、動脈粥樣硬化、高血壓等所導致的心臟、大腦及全身組織發生的缺血性或出血性疾病。心腦血管疾病的常見指標有血清脂質、C反應蛋白(CRP)和同型半胱氨酸(Hcy)。當人體的新陳代謝出現障礙時，同型半胱氨酸由于無法降解而在體內聚集。高濃度的同型半胱氨酸會對血管內壁造成損害，使血管內膜增厚、粗糙，形成斑塊，進而使管腔狹窄甚至阻塞，動脈供血不全，導致動脈粥樣硬化和冠心病的發生。

同型半胱氨酸Hcy、半胱氨酸Cys和甲硫氨酸(Met,也稱蛋氨酸)是體內甲硫氨酸循環的3個重要產物。正常情況下，同型半胱氨酸通過兩條途徑轉化：一是再甲基化，約50％的同型半胱氨酸在甲硫氨酸合成酶的催化作用下，以葉酸作為甲基供體，發生甲基化，重新合成甲硫氨酸。二是轉硫基途徑，另外約50％的同型半胱氨酸在胱硫醚β合成酶的作用下，最終生成半胱氨酸。

現有的臨床心腦血管疾病血液標志物同型半胱氨酸的檢測方法大多采用生化免疫法等，方法的特異性和準確度較低，無法滿足較高的要求。針對上述情況，本發明提出了一種基于高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)技術快速檢測血漿中同型半胱氨酸的方法，為心腦血管疾病的風險預估和個性化干預提供了便利且精準的線索。

發明內容

針對上述技術問題，發明人提供了一種人血漿中同型半胱氨酸的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：1)取人血漿樣品100μL，分別加入10-100μL 10-50μmol/L高胱氨酸-d8溶液、10-30μL堿溶液和20-100μL二硫蘇糖醇溶液，混勻，室溫下孵育10-20min；

2)向步驟1)所述溶液中加入500-1000μL蛋白沉淀劑，混勻，離心；

3)取步驟2)離心后上清液進樣，采用高效液相色譜-三重四極桿質譜儀檢測，獲得所述同型半胱氨酸檢測結果，所述高效液相方法條件如下：

色譜柱Agilent poroshell 120 EC-C18，2.1×50mm，2.7μm；

色譜柱柱溫25-35℃；

進樣量為1-5μL；

流速為0.1-0.3mL/min；

流動相的體積比為0.1％甲酸水:0.1％甲酸甲醇，90～99:10～1。

常規做法是使用DTT進行Hcy的還原，但據現有文獻報道，DTT的還原能力取決于其所處體系的酸堿度，因此申請人選用了NaOH、KOH和氨水進行還原能力的檢測，并通過后期方法學進行系統適應性等相關測定。

發明人發現堿性溶液可以提高DTT的還原能力，因此堿性溶液可以選用NaOH、KOH和氨水。