[發明專利]基因G20E03、其編碼的蛋白及其在提高煙草植株抗大豆孢囊線蟲病中的應用

有效

• 申請號: 202010742888.1
• 申請日: 2020-07-29
• 公開（公告）號: CN111690049B
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發明（設計）人: 宋雯雯;史倩倩;劉蘭亭;趙洪海;梁晨;段方猛
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 青島清泰聯信知識產權代理有限公司 37256
• 代理人: 張潔

本發明公開了一種基因G20E03、其編碼的蛋白及其在提高煙草植株抗大豆孢囊線蟲病中的應用，屬于煙草抗病技術領域，其技術方案包括提供了一種基因G20E03，基因G20E03編碼的蛋白，蛋白在提高煙草植株抗大豆孢囊線蟲病中的應用及基因G20E03在提高煙草植株抗大豆孢囊線蟲病中的應用，通過轉基因技術獲得基因G20E03的RNAi轉基因煙草植株，在轉基因煙草植株中表達基因G20E03的dsRNA，使大豆孢囊線蟲基因G20E03沉默，緩解基因G20E03對煙草植株的免疫抑制作用，提高煙草植株的抗大豆孢囊線蟲病性。本發明應用于煙草抗病方面，具有能夠大量表達煙草大豆孢囊線蟲效應蛋白基因的dsRNA，及顯著抑制大豆孢囊線蟲寄生的特點。通過本發明可獲得強抗大豆孢囊線蟲病的煙草植株。

技術領域

本發明屬于煙草抗病技術領域，尤其涉及一種基因G20E03、其編碼的蛋白及其在提高煙草植株抗大豆孢囊線蟲病中的應用。

背景技術

大豆孢囊線蟲(Heterodera glycines，soybean cyst nematode，SCN)是植物內寄生線蟲，主要侵染大豆(Glycine max)等豆科植物，煙草(Nicotiana tabacum)是其非寄主。但近年來，在山東地區發現一個特殊的能夠侵染煙草的SCN群體(Tobacco population ofsoybean cyst nematode，SCNT)。利用形態學及分子生物學等鑒定手段，將山東省寄生煙草的孢囊線蟲鑒定為大豆孢囊線蟲(Heterodera glycines)。受SCNT侵染的煙草根系，其分叉變多，后期會著生小米粒大小的白色或黃色球形顆粒(孢囊線蟲的雌蟲)，部分受侵染根系出現褐色壞死，最后整條根腐爛、干枯。孢囊線蟲危害煙草的根系，不僅會導致煙葉產量損失和品質下降，而且會加重煙草上其他病害(如煙草枯萎病)的發生，已成為嚴重制約我國山東、河南等地煙區生產的重要因素之一。

目前防治孢囊線蟲的方法主要有輪作、化學防治和選育抗病品種，但是由于輪作的局限性和化學防治給生態環境造成的巨大污染，以及抗線蟲種質資源的匱乏，尋找高效的、可持續的大豆孢囊線蟲防治方法是目前植物寄生線蟲研究領域的重點。

通過基因技術獲得抗病植株是防治農作物病害的有效手段，然而，由于現有技術對于SCNT的研究僅停留在對比SCN與SCNT的致病差異性上，由于SCNT特殊的致病力，使得通過基因技術篩選得到強致病因子并獲得抗大豆孢囊線蟲病的煙草植株仍存在很高的技術難度。

發明內容

針對現有技術存在的不足之處，本發明所要解決的技術問題是克服現有技術難點，系統運用基因技術篩選得到強致病因子并獲得抗大豆孢囊線蟲病的煙草植株，從而有效解決煙草病害的技術問題，提供一種能夠大量表達煙草大豆孢囊線蟲病效應蛋白基因的dsRNA，及有效防治煙草大豆孢囊線蟲病的方法。

為解決所述技術問題，本發明采用的技術方案為：

本發明提出基因G20E03，所述基因G20E03的基因全長序列如SEQ ID NO.1所示。

優選的，所述基因G20E03的基因全長序列包括5’端非編碼區、3’端非編碼區和cDNA區，所述cDNA區的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

優選的，所述基因G20E03由以下方法克隆得到：

使用TRIZOL法提取大豆孢囊線蟲煙草群體的2齡幼蟲RNA，并反轉錄為cDNA；

根據SCNT的轉錄組測序結果設計引物對G20E03-part-F和G20E03-part-R，以上述cDNA為模板進行PCR擴增，得到PCR產物，對所述PCR產物進行純化及T-A連接，得到連接產物，將所述連接產物轉入大腸桿菌中，隨機挑取單菌落，利用所述引物對G20E03-part-F和G20E03-part-R對所述單菌落進行PCR篩選，得到陽性單克隆菌落并測序；