[發明專利]基因G20E03、其編碼的蛋白及其在提高煙草植株抗大豆孢囊線蟲病中的應用

有效

• 申請號: 202010742888.1
• 申請日: 2020-07-29
• 公開（公告）號: CN111690049B
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發明（設計）人: 宋雯雯;史倩倩;劉蘭亭;趙洪海;梁晨;段方猛
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 青島清泰聯信知識產權代理有限公司 37256
• 代理人: 張潔

1.基因G20E03在提高煙草植株抗大豆孢囊線蟲病中的應用，其特征在于，所述基因G20E03的基因全長序列如SEQ ID NO.1所示；通過轉基因技術獲得基因G20E03的RNAi轉基因煙草植株，在轉基因煙草植株中表達基因G20E03的dsRNA，使大豆孢囊線蟲基因G20E03沉默，緩解基因G20E03對煙草植株的免疫抑制作用，提高煙草植株的抗大豆孢囊線蟲病性。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述通過轉基因技術獲得基因G20E03的RNAi轉基因煙草植株包括以下步驟：

構建重組表達載體pFGC5941-RNAi-G20E03；

將重組表達載體pFGC5941-RNAi-G20E03轉化農桿菌LBA4404，得到重組農桿菌；

通過農桿菌介導的葉盤法轉化煙草，進行組織培養，分別利用引物G20E03-part-F和G20E03-part-R、Bar-F和Bar-R檢測均為陽性的轉基因煙草植株即為G20E03的RNAi轉基因煙草植株。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述構建重組表達載體pFGC5941-RNAi-G20E03包括以下步驟：

以大豆孢囊線蟲cDNA為模板，采用RACE法克隆G20E03基因，得到完整的基因序列；

設計引物對G20E03-ORF-R-F和G20E03-ORF-R-R，PCR擴增得到含Xbal和BamH I酶切位點的ORF反向序列，分別使用限制性內切酶Xbal和BamH I進行酶切，純化回收后，連接至經限制性內切酶Xbal和BamH I酶切的植物干擾載體pFGC5941，獲得重組表達載體pFGC5941-G20E03；

設計引物對G20E03-ORF-F-F和G20E03-ORF-F-R，PCR擴增得到含Nco I和Swa I酶切位點的ORF正向序列，分別使用限制性內切酶Nco I和Swa I對重組表達載體pFGC5941-G20E03進行酶切，純化回收后，連接至經限制性內切酶Nco I和Swa I酶切的載體pFGC5941-G20E03，獲得重組表達載體pFGC5941-RNAi-G20E03。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，通過轉基因技術獲得基因G20E03的RNAi轉基因煙草植株還包括：

將T0代轉基因煙草種子采用種子穴盤育苗，并分別利用特異性引物G20E03-part-F和G20E03-part-R、Bar-F和Bar-R進行PCR檢測，得到T1代轉基因煙草；

按照上述方法逐代培養，得到純合的轉基因株系。