[發(fā)明專利]基因G20E03、其編碼的蛋白及其在提高煙草植株抗大豆孢囊線蟲病中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010742888.1
• 申請日: 2020-07-29
• 公開（公告）號: CN111690049B
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋雯雯;史倩倩;劉蘭亭;趙洪海;梁晨;段方猛
• 申請（專利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 青島清泰聯(lián)信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37256
• 代理人: 張潔

1.基因G20E03在提高煙草植株抗大豆孢囊線蟲病中的應(yīng)用，其特征在于，所述基因G20E03的基因全長序列如SEQ ID NO.1所示；通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得基因G20E03的RNAi轉(zhuǎn)基因煙草植株，在轉(zhuǎn)基因煙草植株中表達(dá)基因G20E03的dsRNA，使大豆孢囊線蟲基因G20E03沉默，緩解基因G20E03對煙草植株的免疫抑制作用，提高煙草植株的抗大豆孢囊線蟲病性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得基因G20E03的RNAi轉(zhuǎn)基因煙草植株包括以下步驟：

構(gòu)建重組表達(dá)載體pFGC5941-RNAi-G20E03；

將重組表達(dá)載體pFGC5941-RNAi-G20E03轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，得到重組農(nóng)桿菌；

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，進(jìn)行組織培養(yǎng)，分別利用引物G20E03-part-F和G20E03-part-R、Bar-F和Bar-R檢測均為陽性的轉(zhuǎn)基因煙草植株即為G20E03的RNAi轉(zhuǎn)基因煙草植株。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述構(gòu)建重組表達(dá)載體pFGC5941-RNAi-G20E03包括以下步驟：

以大豆孢囊線蟲cDNA為模板，采用RACE法克隆G20E03基因，得到完整的基因序列；

設(shè)計(jì)引物對G20E03-ORF-R-F和G20E03-ORF-R-R，PCR擴(kuò)增得到含Xbal和BamH I酶切位點(diǎn)的ORF反向序列，分別使用限制性內(nèi)切酶Xbal和BamH I進(jìn)行酶切，純化回收后，連接至經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xbal和BamH I酶切的植物干擾載體pFGC5941，獲得重組表達(dá)載體pFGC5941-G20E03；

設(shè)計(jì)引物對G20E03-ORF-F-F和G20E03-ORF-F-R，PCR擴(kuò)增得到含Nco I和Swa I酶切位點(diǎn)的ORF正向序列，分別使用限制性內(nèi)切酶Nco I和Swa I對重組表達(dá)載體pFGC5941-G20E03進(jìn)行酶切，純化回收后，連接至經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nco I和Swa I酶切的載體pFGC5941-G20E03，獲得重組表達(dá)載體pFGC5941-RNAi-G20E03。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得基因G20E03的RNAi轉(zhuǎn)基因煙草植株還包括：

將T0代轉(zhuǎn)基因煙草種子采用種子穴盤育苗，并分別利用特異性引物G20E03-part-F和G20E03-part-R、Bar-F和Bar-R進(jìn)行PCR檢測，得到T1代轉(zhuǎn)基因煙草；

按照上述方法逐代培養(yǎng)，得到純合的轉(zhuǎn)基因株系。