[發明專利]一種基于高通量測序技術用于線粒體高變區復合擴增的引物組合、測序方法及其應用

在審

• 申請號: 202010741564.6
• 申請日: 2020-07-29
• 公開（公告）號: CN111676280A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發明（設計）人: 王升啟;唐召兵;張慶珍;周喆;劉麗艷;劉琪琦
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 王煥

本發明提供了一種基于高通量測序技術用于線粒體高變區復合擴增的引物組合、測序方法及其應用，涉及高通量測序技術領域。所述引物組合包括5對引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示。本發明還提供了用于線粒體高變區的高通量基因測序的方法，所述方法包括利用SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示引物組合構建測序文庫；采用高通量測序的方法對所述測序文庫進行檢測。本發明提供的用于線粒體高變區復合擴增的引物組合以及測序方法能夠同時檢測多個樣本的線粒體高變區基因，有效提高檢測效率、準確率、靈敏度，同時降低了成本、簡化了操作步驟，通過單管反應即可獲得檢測結果。

技術領域

本發明涉及高通量測序技術領域，尤其是涉及一種基于高通量測序技術用于線粒體高變區復合擴增的引物組合、測序方法及其應用。

背景技術

線粒體DNA(mtDNA)作為一種獨立存在的遺傳物質，其高突變率是造成其遺傳多樣性的重要原因，不僅是個體身份識別不可或缺的技術手段，也是研究母系群體進化遷移的生物學工具。人類mtDNA為環狀雙鏈結構，長16569bp，線粒體DNA的非編碼區(也稱為控制區)，控制區的堿基變異相對集中分布在15996-16401和29-408區段，分別稱為HV1和HV2，后有研究者發現438-574之間也存在較多的堿基變異，稱為HV3。當在單個個體中存在不止一種類型的mtDNA(即出現兩種或兩種以上的堿基序列)時，這種現象稱mtDNA的異質性。

檢測不同水平的mtDNA異質性，需要依靠具有不同靈敏度的不同檢測方法。DNASanger測序目前仍是金標準，但是只能檢測出mtDNA異質性大于10-15％或10-20％以上的位點。時相溫度梯度凝膠電泳(temporal temperature gradient gel electrophoresis，TTGE)可以檢測到突變頻率為4％的mtDNA異質性位點。變性高效液相色譜(Denaturinghigh performance liquid chromatography，DHPLC)是一種高通量的基因突變檢測技術，可以檢測到突變頻率為1％的mtDNA異質性位點，因此DHPLC技術在個體身份識別領域應用比較廣泛。隨著測序技術的發展，高通量測序技術由于其高覆蓋度、高靈敏度及低成本等優勢倍受研究人員青睞，也逐步應用于mtDNA異質性研究，但是目前還沒有形成統一標準，使用不同的儀器、化學試劑以及不同的異質性評判標準，各實驗室之間的檢測結果也會有很大的差異。由于mtDNA異質性在疾病、個體身份識別、親子鑒定和犯罪嫌疑人認定等方面均有重要意義，因此提高mtDNA異質性檢測的靈敏度就尤為必要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于高通量測序技術用于線粒體高變區復合擴增的引物組合、測序方法及其應用，本發明提供的用于線粒體高變區復合擴增的引物組合以及測序方法劑能夠同時檢測多個樣本的線粒體高變區基因，有效提高檢測效率、準確率、靈敏度。

本發明是通過以下技術方案實現的：

在一方面，本發明提供了一種基于高通量測序技術用于線粒體高變區復合擴增的引物組合，所述引物組合包括5對引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；SEQID NO.3和SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；以及SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

在另一方面，本發明提供了一種用于線粒體高變區的高通量基因測序的方法，所述方法包括利用本發明所述引物組合構建測序文庫；采用高通量測序的方法對所述測序文庫進行檢測。

在一個實施方案中，利用本發明所述引物組合構建測序文庫包括：

(a)利用本發明所述引物組合對不同樣本的線粒體高變區基因進行PCR擴增，得到第一擴增產物；

(b)以第一擴增產物為模板進行接頭序列PCR擴增反應及產物純化，得到包含所述線粒體高變區基因的測序文庫。