[發(fā)明專利]一種基于高通量測序技術(shù)用于線粒體高變區(qū)復(fù)合擴(kuò)增的引物組合、測序方法及其應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2020-07-29
• 公開（公告）號: CN111676280A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王升啟;唐召兵;張慶珍;周喆;劉麗艷;劉琪琦
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 王煥

1.一種基于高通量測序技術(shù)用于線粒體高變區(qū)復(fù)合擴(kuò)增的引物組合，其特征在于，所述引物組合包括5對引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；以及SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

2.一種用于線粒體高變區(qū)的高通量基因測序的方法，其特征在于，所述方法包括利用權(quán)利要求1所述的引物組合構(gòu)建測序文庫；采用高通量測序的方法對所述測序文庫進(jìn)行檢測。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述利用權(quán)利要求1所述的引物組合構(gòu)建測序文庫包括：

(a)利用權(quán)利要求1所述的引物組合對不同樣本的線粒體高變區(qū)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物；

(b)以第一擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行接頭序列PCR擴(kuò)增反應(yīng)及產(chǎn)物純化，得到包含所述線粒體高變區(qū)基因的測序文庫。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中，在PCR擴(kuò)增體系中，引物按終濃度不同分為三組，

A組：SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8所示序列的引物，

B組：SEQ ID NO.7所示序列的引物，

C組：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.10所示序列的引物；

三組引物終濃度的比例A組：B組：C組為2：4：1，優(yōu)選地，三組引物終濃度A組：B組：C組分別為0.2μM：0.4μM：0.1μM。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在所述步驟(a)和所述步驟(b)之間還包括純化的步驟，優(yōu)選進(jìn)行磁珠純化，更優(yōu)選經(jīng)AMPure XP磁珠純化。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在所述步驟(b)中，在將已純化PCR產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)、將修復(fù)末段連接接頭和連接有接頭的產(chǎn)物磁珠純化后，再進(jìn)行接頭序列PCR擴(kuò)增。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述接頭序列PCR擴(kuò)增過程中使用i7引物以及i5引物進(jìn)行擴(kuò)增，所i7引物以及i5引物的序列分別如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述采用高通量測序的方法對所述測序文庫進(jìn)行檢測包括進(jìn)行文庫定量、高通量檢測和數(shù)據(jù)分析；

優(yōu)選地，高通量測序采用MiSeq FGx測序；

優(yōu)選地，所述數(shù)據(jù)分析為采用NextGENe軟件分析突變位點(diǎn)、變異頻率、突變類型和/或覆蓋深度。

9.一種基于高通量測序測序技術(shù)用于mtDNA異質(zhì)性檢測的方法，所述方法包括通過權(quán)利要求2-8任一項(xiàng)所述的方法獲得數(shù)據(jù)分析結(jié)果，根據(jù)數(shù)據(jù)比對分析確定高通量測序樣本的單倍型，然后進(jìn)行mtDNA異質(zhì)性分析。

10.權(quán)利要求1所述的引物組合在構(gòu)建用于檢測線粒體高變區(qū)基因變異的高通量測序文庫中的應(yīng)用。