[發明專利]一種肌鈣蛋白I E13單鏈抗體的制備方法

有效

• 申請號: 202010738229.0
• 申請日: 2020-07-28
• 公開（公告）號: CN112679607B
• 公開（公告）日: 2022-11-25
• 發明（設計）人: 鄒繼華;武強;張莉;杜東芳;賈江花;何進軍;方亮;鄒炳德
• 申請（專利權）人: 美康生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N15/13;C12N15/70;G01N33/577
• 代理公司: 寧波甬致專利代理有限公司 33228
• 代理人: 李迎春

本發明首先以E13雜交瘤細胞株為原料提取總mRNA，以此為模板反轉錄得到cDNA，選用IgG保守區序列特異性引物擴增單抗的輕鏈可變區和重鏈可變區基因，將擴增得到的輕、重鏈可變區基因序列在IMGT數據庫進行生物信息學分析，得到序列準確可靠的候選輕鏈和重鏈可變區基因，通過本發明的制備方法獲得cTnI E13單克隆細胞株的輕重鏈可變區基因序列，實現以基因序列形式對E13單抗細胞株實現永久保種；并提供一種原核表達E13單鏈抗體的制備方法，為后續建立過程簡易，成本低廉的診斷抗體原料制備工藝提供基礎。

技術領域

本發明涉及肌鈣蛋白I E13單鏈抗體的制備，具體是從E13單克隆細胞株中克隆出輕重鏈可變區基因，并構建單鏈抗體重組表達工程菌，得到能用于配制肌鈣蛋白I測定試劑(免疫法)的單鏈抗體原料。

背景技術

據世界衛生組織統計，目前冠心病是世界十大死因中排行第一的疾病，全球每年約有1700萬人死于冠心病，被稱為“人類健康的第一殺手”。急性心肌梗死(acutemyocardial infarction，AMI)是造成冠心病人死亡的主要原因。AMI典型病例可以根據病史、癥狀及心電圖的特殊改變進行診斷，但大量的臨床實踐發現，約有25％的AMI病人發病早期并無典型的臨床癥狀，約50％的AMI病人缺乏心電圖的特異改變，在此情況下，檢測血液中的心肌損傷標志物具有重要價值。目前，肌鈣蛋白I(cTnI)因在穩定性、特異性及靈敏度等方面的綜合優勢，已獲得美國心臟協會(AHA)，美國心臟病學會(ACC)和歐洲心臟病學會(ESC)等眾多權威組織的認可，逐漸成為AMI診斷的“金標準”。

臨床應用的cTnI免疫檢測試劑盒主要包括免疫反應體系(抗體特異性識別抗原)和信號輸出體系(反應信號放大和讀取方式)，其中免疫反應體系中所需的抗體質量對免疫檢測系統性能起決定性作用，目前常用的cTnI抗體大多是通過雜交瘤技術制備的全長單抗，但因全長單抗制備的生產工藝流程復雜、開發周期長、投入成本高等原因，致使抗體原料成為免疫檢測試劑生產成本降低的一大制約因素。另外，分泌全長單抗的雜交瘤細胞株使用幾代后逐漸退化，產量降低，甚至有染色體丟失失去抗體分泌能力的風險。

發明內容

本發明針對現有技術的上述不足，提供一種肌鈣蛋白I E13單鏈抗體的制備方法。

本發明的目的是通過基因克隆技術獲得cTnI E13單克隆細胞株的輕重鏈可變區基因序列，從而實現以基因序列形式對E13單抗細胞株實現永久保種；另一目的是提供一種原核表達E13單鏈(scFv)抗體的制備方法。

本發明的目的將通過以下技術方案實現：

1).E13單克隆細胞株總RNA提取

取適量分泌cTnI E13單抗的雜交瘤細胞株，采用Trizol試劑法提取總RNA，再依次經氯仿萃取和乙醇洗滌后獲得總RNA。通過測定RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀值確定RNA濃度和受蛋白污染情況；通過瓊脂糖電泳觀測28S/18S條帶情況，確定提取的RNA完整性和DNA污染情況。具體步驟如下：

1.1)取適量雜交瘤細胞按一定比例加入Trizol試劑后，室溫放置一定時間，使其充分裂解。12000g離心5min，棄沉淀；

1.2)按與加入Trizol體積的一定比例加入氯仿，振蕩混勻后室溫放置一定時間。4℃12000g離心15min；

1.3)吸取上層水相，至另一離心管中。按加入Trizol體積的一定比例加入異丙醇混勻，室溫放置一定時間；4℃12000g離心10min，棄上清，RNA沉于管底；

1.4)按加入Trizol體積的一定比例加入75％乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；4℃8000g離心5min，盡量棄上清；