[發明專利]一種肌鈣蛋白I E13單鏈抗體的制備方法

有效

• 申請號: 202010738229.0
• 申請日: 2020-07-28
• 公開（公告）號: CN112679607B
• 公開（公告）日: 2022-11-25
• 發明（設計）人: 鄒繼華;武強;張莉;杜東芳;賈江花;何進軍;方亮;鄒炳德
• 申請（專利權）人: 美康生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N15/13;C12N15/70;G01N33/577
• 代理公司: 寧波甬致專利代理有限公司 33228
• 代理人: 李迎春

1.一種肌鈣蛋白I E13單鏈抗體，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。

2.一種如權利要求1所述的肌鈣蛋白IE13單鏈抗體的制備方法，其特征在于，制備步驟包括：

(1)E13單克隆細胞株總RNA提取：

取適量分泌cTnI E13單抗的雜交瘤細胞株，采用Trizol試劑法提取總RNA，再依次經氯仿萃取和乙醇洗滌后獲得總RNA；通過測定RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀值確定RNA濃度和受蛋白污染情況；通過瓊脂糖電泳觀測28S/18S條帶情況，確定提取的RNA完整性和DNA污染情況；

(2)E13單抗基因克隆：

采用cDNA末端快速擴增技術進行單抗基因的克隆擴增，采用商品化的RACE5’/3’試劑盒進行試驗；

(3)輕重鏈可變區測序結果分析：

采用IMGT數據庫以及NCBI數據庫中的IgBLAST功能分別對輕、重鏈可變區基因的Sanger測序結果進行分析，包括對胚系基因同源性、開放閱讀框的合理性、可變區的互補決定區(CDR)和骨架區(FR)序列長度以及信號肽序列完整性等生物信息進行分析，并排除來源宿主細胞的抗體基因和假基因，最終選擇完整準確的可變區基因序列進行下一步的scFv基因構建；

(4)scFv基因修飾及合成：

scFv是由抗體重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL通過幾十個氨基酸的短肽連接而成，將通過基因克隆獲得的E13單抗VH和VL序列用短肽連接，在其-NH₂端添加原核分泌信號肽，在-COOH端添加定點標記和純化短肽標簽，可供后續scFv單鏈抗體進行生物素化或信號物質標記的定點修飾，以及進行金屬螯合親和層析的純化標簽；另外，分別在scFv基因的5’和3’端添加合適的限制性酶切位點，便于后續重組表達載體的構建，將以上基因序列合成scFv基因；

(5)scFv重組載體構建及表達：

將合成的scFv基因片段和選定的表達載體采用對應的限制性內切酶在合適溫度下進行一定時間的酶切反應，采用T4 DNA連接酶在合適溫度下反應一定時間進行連接，得到重組表達載體，最后將重組載體轉化至合適的感受態細胞，涂Amp-LB培養基平板，在37℃條件下過夜培養，挑選單菌落進行PCR及酶切鑒定，對陽性克隆菌進行基因測序確認；將測序正確的scFv重組載體質粒分別轉化E.coli BL21(DE3)感受態細胞，涂Amp-LB培養基平板，在37℃條件下過夜培養后挑取單菌落，接種至含Amp-LB液體培養基中在一定溫度下進行搖床培養，當菌液生長密度達到OD600＝0.8時，加入一定終濃度的IPTG，再繼續培養一定時間進行誘導表達，離心收集菌體；

(6)scFv重組表達蛋白純化：

取適量scFv菌體重懸于緩沖液I中，超聲破碎后進行離心，收集離心上清，在pure蛋白純化系統上進行層析柱純化，最后將含目的蛋白的洗脫液透析至緩沖液II中，收樣待用；

(7)scFv片段抗體性能驗證：

采用雙抗夾心法驗證scFv單鏈抗體的抗原反應性。