[發明專利]一種干血斑中四種維生素的檢測方法及檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202010737975.8
• 申請日: 2020-07-28
• 公開（公告）號: CN111983244A
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 李艷;周傳貴;周玉松;李艷杰;胡瑋;韓文念;徐振;程文播
• 申請（專利權）人: 天津國科醫工科技發展有限公司
• 主分類號: G01N33/82
• 分類號: G01N33/82;G01N30/02
• 代理公司: 天津企興智財知識產權代理有限公司 12226
• 代理人: 王雨杰

1.一種干血斑中四種維生素檢測試劑盒，其特征在于：包括校準品、質控品、內標混合液、第一提取液、第二提取液、復溶液、流動相A、流動相B和洗針液；所述內標混合液為氘代維生素A、氘代25羥基維生素D2、氘代25羥基維生素D3和氘代維生素E。

2.根據權利要求1所述的一種干血斑中四種維生素檢測試劑盒，其特征在于：所述校準品為含有梯度濃度維生素A、D、E的干血斑，所述校準品的制備方法為：先用甲醇稀釋維生素A、D、E標品溶劑到梯度濃度，然后與全血混合均勻，滴加到干血斑晾干封裝；所述校準品中維生素A的濃度范圍為50-2000ng/mL，25羥基維生素D2濃度范圍為5-40ng/mL，25羥基維生素D3濃度范圍為5-200ng/mL，維生素E的濃度范圍1-40μg/mL。

3.根據權利要求1所述的一種干血斑中四種維生素檢測試劑盒，其特征在于：所述質控品包括第一質控品、第二質控品和第三質控品，且三者濃度依次升高；所述第一質控品中維生素A的含量范圍為50-200ng/mL，25羥基維生素D2的含量范圍為5-15ng/mL，25羥基維生素D3的含量范圍為5-20ng/mL，維生素E的含量范圍分別為1-4μg/mL；第二質控品中維生素A的含量范圍為400-1000ng/mL，25羥基維生素D2的含量范圍為20-30ng/mL，25羥基維生素D3的含量范圍為35-100ng/mL，維生素E的含量范圍為8-20μg/mL；第三質控品中維生素A的含量范圍為1600-2000ng/mL、25羥基維生素D2的含量范圍為35-40ng/mL、25羥基維生素D3的含量范圍為160-200ng/mL、維生素E的含量范圍為30-40μg/mL。

4.根據權利要求3所述的一種干血斑中四種維生素檢測試劑盒，其特征在于：所述質控品的制備方法為：用甲醇分別配制具有第一質控品、第二質控品和第三質控品相應濃度的校準品，然后將相應的校準品與全血混合均勻，滴加到干血斑上晾干封裝，即得第一質控品、第二質控品和第三質控品。

5.根據權利要求4所述的一種干血斑中四種維生素檢測試劑盒，其特征在于：所述干血斑中維生素A、D、E的檢測試劑盒還包括內標混合液、第一提取液、第二提取液、復溶液、流動相A、流動相B和洗針液；所述內標為氘代維生素A、氘代25羥基維生素D2、氘代25羥基維生素D3、氘代維生素E的混合溶液；內標中氘代維生素A濃度范圍為1-5μg/mL，氘代25羥基維生素D2濃度范圍為100-300ng/mL，氘代25羥基維生素D3濃度范圍為300-600ng/mL，氘代維生素E濃度范圍為10-30μg/mL。

6.根據權利要求5所述的一種干血斑中四種維生素檢測試劑盒，其特征在于：所述第一提取液為甲醇和乙腈混合溶液；甲醇與乙腈的體積比為1：1，所述第二提取液為正己烷；所述復溶液為甲醇水；所述流動相A為含甲酸的水溶液，甲酸與水的體積比為0.1％；所述流動相B為含甲酸的甲醇溶液，甲酸與甲醇的體積比為0.1％；所述洗針液為甲醇和水按體積比1:1混合的混合溶液。

7.根據權利要求1至6任意一項所述的一種干血斑中四種維生素的檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)樣品制備：吸取一定量的全血滴到濾紙上，室溫晾干置于塑料密封袋中，冷凍儲存備用；

(2)樣本處理：工作人員從干血斑上取下整個血斑，將該血斑與事先調配好的第一提取液、第二提取液、內標混合液渦旋混合密封，并于20-30℃的條件下超聲水浴孵化；將孵化樣品于-20℃冷凍10-20min,并于4-10℃冷凍離心5-10min，取400-550μL上清液進行氮吹，再用50-100μL復溶液復溶進樣，用液相色譜-串聯質譜檢測；

(3)檢測結果計算：將校準品出峰面積與對應內標出峰面積的比值作為縱坐標，校準品溶液的濃度作為橫坐標，擬合線性方程得到校準品標準曲線；再將質控品樣本的峰面積帶入標準曲線中計算得到實際的濃度。

8.根據權利要求7所述的一種干血斑中四種維生素的檢測方法，其特征在于：所述液相色譜-串聯質譜檢測的液相色譜條件為：流動相A為含甲酸的水溶液，流動相B為含甲酸的甲醇溶液；色譜柱為Kinetex C18，50*3mm，2.6μm；柱溫為40℃；檢測時間為5min；進樣量為10-20μL；梯度洗脫條件：0-0.5min，70％B，0.5-1.5min，100％B，1.5-3.5min，100％B，3.5-3.6min，70％B，3.6-5min，70％B，流速0.4-0.8mL/min；質譜條件為：正離子模式，采用ESI源，碰撞氣3-5psi，氣簾氣20-40psi，霧化氣40-70psi，輔助加熱氣40-70psi，噴霧電壓5000V，霧化溫度300-500℃。