[發明專利]一種吡嘧磺隆水解酶基因pyfE及其編碼的蛋白與應用

在審

• 申請號: 202010737689.1
• 申請日: 2020-07-28
• 公開（公告）號: CN112980855A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 張浩;李娜;韋宇平;柳成賓;王鵬;陳兆進;韓輝;滑紫微
• 申請（專利權）人: 南陽師范學院
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/14;C12N15/66;C12N15/70;C12N1/21;B09C1/10;C12R1/19
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 夏晏平

本發明提供了一種吡嘧磺隆水解酶基因pyfE及其編碼的蛋白與應用，水解酶基因pyfE的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO.1，用于編碼吡嘧磺隆水解酶蛋白。吡嘧磺隆水解酶蛋白的氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO.2。本發明提取了首個吡嘧磺隆降解基因，其本身的核苷酸序列可以用于構建抗吡嘧磺隆轉基因作物，有效解除藥害。本發明還提供了水解酶PyfE的純化方法，投入污染土壤中，可有效降解吡嘧磺隆殘留。

技術領域

本發明涉及一種吡嘧磺隆水解酶基因pyfE及其編碼的蛋白與應用。

背景技術

在我國，化學農藥的使用是保證農產品產量的重要措施。磺酰脲類除草劑是目前世界上使用量最大的除草劑之一，具有高效廣譜、對哺乳動物低毒、使用方式多樣、品種多、針對性強、便于儲存和運輸等優點。雖然磺酰脲類除草劑具有許多其它種類除草劑無可比擬的優點，但部分磺酰脲類除草劑殘留期較長，其在土壤中的殘留累積嚴重，會對下茬作物產生藥害，從而造成巨大的經濟損失。

吡嘧磺隆是磺酰脲類側鏈氨基酸合成抑制劑，具有活性高、傳導速度快、持效期長的特點，主要用于水稻田的闊葉雜草、莎草等惡性雜草的防治，但吡嘧磺隆在土壤中的半衰期長，移動性較強，易對土壤和地下水造成污染，尤其在吡嘧磺隆生產企業排出的工業廢水中，吡嘧磺隆含量較高，對環境與作物安全性的影響大。利用功能微生物修復污染環境是一種原位生物修復技術，具有高效、經濟，無二次污染等特點，是土壤和水體有機污染物修復技術的主流和發展方向。近年來，國內外有關磺酰脲類除草劑在土壤中的微生物降解研究已有報道，參與降解磺酰脲類除草劑的微生物有真菌、細菌和放線菌。而關于吡嘧磺隆微生物降解的研究較少，降解過程中關鍵酶基因未有報道，代謝途徑與降解機制尚不清楚，嚴重制約了吡嘧磺隆污染環境的修復及生態安全方面的研究。

發明內容

本發明的一個目的是要提供一種吡嘧磺隆水解酶基因pyfE及其編碼的蛋白與應用，從而安全、快速地提高吡嘧磺隆降解效率。

特別地，本發明提供了一種吡嘧磺隆水解酶基因pyfE，用于編碼吡嘧磺隆水解酶蛋白，所述水解酶基因pyfE的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO.1。

本發明還提供了一種吡嘧磺隆水解酶蛋白PyfE，所述吡嘧磺隆水解酶蛋白的氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO.2。

本發明還提供了一種吡嘧磺隆水解酶基因pyfE的表達載體pET29a-pyfE的構建方法，包括以下步驟：

S1：設計一對用于水解酶基因pyfE核酸序列的特異性引物，正向引物引入了NdeⅠ酶切位點，反向引物引入了HindⅢ酶切位點；

S2：通過PCR擴增含有酶切位點的pyfE基因，所述pyfE基因不含有終止密碼子；

S3：將S2的PCR產物用限制性核酸內切酶NdeⅠ和HindⅢ雙酶切，并用凝膠回收試劑盒純化；

S4：將S3的產物與經過同樣雙酶切處理的pET29a載體通過T4 DNA連接酶連接，從而獲得重組表達載體pET29a-pyfE。

優選的，所述特異性引物為，

正向引物：

S-F:5’-CTGATTGCATATGGAAACTGACAACGTGGAGCT-3’；

反向引物：

S-R:5’-TACAAGCTTGCTTTCGTTCTGATCTAAGC-3’。

本發明公開的從吡嘧磺隆降解細菌BI-1克隆得到的水解酶基因pyfE，為首個吡嘧磺隆降解基因，斷裂吡嘧磺隆側鏈的酯鍵，形成相應的酸，對吡嘧磺隆微生物降解機制及生態安全方面的研究有重要的意義，也可以通過現代生物技術將降解基因導入作物中，構建抗吡嘧磺隆的轉基因作物，有效解除藥害。