[發明專利]一種Bacillus sphaericus耐有機溶劑蛋白酶突變體

在審

• 申請號: 202010735420.X
• 申請日: 2020-07-28
• 公開（公告）號: CN111979215A
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 劉姝;房耀維;盧靜;楊杰;楊光;焦豫良;吳新財;張唯;張弘彧
• 申請（專利權）人: 江蘇海洋大學
• 主分類號: C12N9/54
• 分類號: C12N9/54;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 嚴志平

本發明公開了一種Bacillus sphaericus耐有機溶劑蛋白酶突變體，其特征在于：將Bacillus sphaericus蛋白酶基因進行如下突變：39位蘇氨酸（T）突變為脯氨酸（P），87位谷氨酰胺（Q）突變為脯氨酸（P），108位絲氨酸（S）突變為甘氨酸（G），172位酪氨酸（Y）突變為谷氨酸（E），198位天冬酰胺（N）突變為色氨酸（W），所述Bacillus sphaericus耐有機溶劑蛋白酶突變體基因密碼子優化序列如附錄1所示，所述Bacillus sphaericus氨基酸序列GenBank收錄號為AJ238598.1；本發明公開的Bacillus sphaericus耐有機溶劑蛋白酶突變體，相較于突變前，突變酶的有機溶劑耐受性是野生型酶的3.15倍，突變蛋白酶對有機溶劑的耐受性更好，更加適合工業生產的要求。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，公開了一種Bacillus sphaericus耐有機溶劑蛋白酶突變體。

背景技術

蛋白酶是一類水解酶，可以催化蛋白質和多肽中肽鍵的水解，屬于第3類水解酶的第4亞類（EC 3.4），由于蛋白酶在催化反應時具有反應速度快、條件溫和、高專一性、高選擇性等諸多優點，被廣泛的應用于蛋白質、洗滌劑、食品、制藥、制革等許多領域，但由于工業應用過程中的苛刻條件如：高溫、強酸、強堿及化學有機溶劑等，蛋白酶容易失去活性，在這些極端條件下的低穩定性極大地限制了蛋白酶在各個領域的應用。

近年來，非水酶學迅速發展，進一步拓展了蛋白酶在有機合成領域的應用，與傳統的水相催化相比，使用有機溶劑作為催化介質有很多優點：（1）可以提高非極性底物或產物的溶解性；（2）可以進行不能在水相中進行的合成反應，控制反應進行的方向；（3）可以減少產物對酶的反饋抑制作用：（4）可以提高手性化合物不對稱反應的對映選擇性；（5）有機溶劑介質種類較多，可以根據反應需要選擇；（6）可以提高酶使用的連續性；（7）反應所得的產物易于純化回收；（8）可以控制放反應的的進程，得到特定的反應中間體，幫助研究反應機制。然而大多數天然蛋白酶在有機溶劑中的穩定性極差，易失去活性，這極大的限制了蛋白酶在有機合成領域的應用。目前已有大量的研究表明通過溶劑工程和生物催化工程可以提高酶對有機溶劑的耐受性，但這些方法不僅成本高，且易導致酶活性下降，因此獲得天然有機溶劑穩定性蛋白酶或利用蛋白質工程改造蛋白酶，以增加其有機溶劑耐受性，可以顯著降低成本，因此本發明基于酶工程尤其是定向進化技術的快速發展，為提高酶的有機溶劑耐受性提供了新的方法：通過利用定點突變、定點飽和突變、DNA-shuffling等技術可以改善酶的有機溶劑耐受性，使之更好的滿足工業催化中的需要。

發明內容

本發明提供了一種Bacillus sphaericus耐有機溶劑蛋白酶突變體，通過定點突變改造蛋白酶酶基因，使所編碼的蛋白酶的有機溶劑耐受性增加，突變酶的有機溶劑耐受性是野生型酶的3.15倍，更加適合工業化生產需求，滿足社會生產的要求，具體技術方案如下：

一種Bacillus sphaericus耐有機溶劑蛋白酶突變體，其特征在于：將Bacillussphaericus蛋白酶基因進行如下突變：39位蘇氨酸（T）突變為脯氨酸（P），87位谷氨酰胺（Q）突變為脯氨酸（P），108位絲氨酸（S）突變為甘氨酸（G），172位酪氨酸（Y）突變為谷氨酸（E），198位天冬酰胺（N）突變為色氨酸（W），所述Bacillus sphaericus耐有機溶劑蛋白酶突變體基因密碼子優化序列如附錄1所示，所述Bacillus sphaericus氨基酸序列GenBank收錄號為AJ238598.1。

進一步的，編碼Bacillus sphaericus耐有機溶劑蛋白酶突變體的基因。

進一步的，攜帶權利要求2所述基因的質粒和細胞，其中質粒為ppicZalphA，用于克隆的感受態細胞：E. coli DH5α；用于表達的感受態細胞：Pichia Pastoris X33。