[發明專利]一種Bacillus sphaericus耐有機溶劑蛋白酶突變體

在審

• 申請號: 202010735420.X
• 申請日: 2020-07-28
• 公開（公告）號: CN111979215A
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 劉姝;房耀維;盧靜;楊杰;楊光;焦豫良;吳新財;張唯;張弘彧
• 申請（專利權）人: 江蘇海洋大學
• 主分類號: C12N9/54
• 分類號: C12N9/54;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 嚴志平

1.一種Bacillus sphaericus耐有機溶劑蛋白酶突變體，其特征在于：將Bacillus sphaericus蛋白酶基因進行如下突變：39位蘇氨酸（T）突變為脯氨酸（P），87位谷氨酰胺（Q）突變為脯氨酸（P），108位絲氨酸（S）突變為甘氨酸（G），172位酪氨酸（Y）突變為谷氨酸（E），198位天冬酰胺（N）突變為色氨酸（W），所述Bacillus sphaericus耐有機溶劑蛋白酶突變體基因密碼子優化序列如附錄1所示，所述Bacillus sphaericus氨基酸序列GenBank收錄號為AJ238598.1。

2.根據權利要求1所述的一種Bacillus sphaericus耐有機溶劑蛋白酶突變體，其特征在于：編碼Bacillus sphaericus耐有機溶劑蛋白酶突變體的基因。

3.根據權利要求2所述的一種Bacillus sphaericus耐有機溶劑蛋白酶突變體，其特征在于：攜帶權利要求2所述基因的質粒和細胞，其中質粒為ppicZalphA，用于克隆的感受態細胞：E. coli DH5α；用于表達的感受態細胞：Pichia Pastoris X33。

4.一種如權利要求1所述的Bacillus sphaericus耐有機溶劑蛋白酶突變體的制備方法，其特征在于：將Bacillus sphaericus蛋白酶基因sph序列進行密碼子優化，通過設計引物對編碼蛋白酶的基因進行定點突變后表達，具體包括如下步驟：

（1）以質粒ppicZalphA為模板設計引物進行突變；

（2）將突變后的質粒轉化進入E. coli DH5α 進行擴增；

（3）以Pichia Pastoris X33表達含突變基因的重組質粒，得到耐有機溶劑性增強的蛋白酶突變體；

（4）將含有編碼蛋白酶的基因的重組P. pastoris X33 (ppicZalphA-sph)進行甲醇誘導表達，發酵培養獲取蛋白酶粗酶液。

5.根據權利要求4所述的一種Bacillus sphaericus耐有機溶劑蛋白酶突變體的制備方法，其特征在于：所述定點突變的引物如下：

F-T39P：5’-TGGTGTCAACCCATCTCACCCAGACTTGGTTAACAACGT-3’

R-T39P：5’-TCTGGGTGAGATGGGTTGACACCAGTGTCCAAAACAGCA

F-Q87P：5’-GGTGGTTCTGATCCAGCTGGTATCTACGGTGTTGCT-3’

R-Q87P：5’-TAGATACCAGCTGGATCAGAACCACCATCAGCCAA-3’

F-S108G：CAAGGTTTTGTTGGACGGTGGTTCTGGTTACTCCGATGA

R-S108G：CGGAGTAACCAGAACCACCGTCCAACAAAACCTTGTAGGCC

F-Y 172 E：GCTGCTGGTAACTCTGGTGAAGCTCAAGGTACTATTGGATACC

R-Y172 E：AATAGTACCTTGAGCTTCACCAGAGTTACCAGCAGCAGCGAC

F- N198W：CTTGGAGAACGTTCAACAGTGGGGTACTTACAGAGTTGCCGACTA

R-N198W：CGGCAACTCTGTAAGTACCCCACTGTTGAACGTTCTCCAAGGCAG。