[發明專利]一種酶切探針恒溫檢測結核分枝桿菌核酸的試劑盒

有效

• 申請號: 202010733483.1
• 申請日: 2020-07-27
• 公開（公告）號: CN111793703B
• 公開（公告）日: 2023-09-22
• 發明（設計）人: 劉利成;王華貴;劉艷;馮華華;王鵬志
• 申請（專利權）人: 江蘇宏微特斯醫藥科技有限公司;北京宏微特斯生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京玄法律師事務所 16002
• 代理人: 潘滿根

本發明提供一種酶切探針恒溫檢測結核分枝桿菌核酸的試劑盒，所述試劑盒包括檢測結核分枝桿菌IS6110基因等溫擴增引物和相應可被RNaseH酶切的探針；檢測結核分枝桿菌Pab基因的等溫擴增引物和相應可被RNaseH酶切的探針。利用高效的恒溫擴增的引物與探針，可以對結核分枝桿菌進行恒溫的多重檢測，具有高靈敏度與高特異性。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，特別涉及一種酶切探針恒溫檢測結核分枝桿菌核酸的試劑盒。

背景技術

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病。結核分枝桿菌入侵身體各個器官，但以肺部感染為主，稱為肺結核。結核病又稱為癆病和“白色瘟疫”，是伴隨人類歷史最長的疾病之一。目前，全世界約有1/3的人感染結核分枝桿菌，每年有900萬的新病例出現，其中有80％集中在發展中國家。我國結核疫情在世界22個結核病高負擔國家中排名第二，每年死于結核病的人多達25萬。因此早期準確的診斷與活動期監測結核病，是治療和控制這種呼吸道傳染病的基礎和前提，尋找快速、準確的診斷方法一直是結核病學的首要研究領域。

目前，對于結核分支桿菌的診斷方法主要有：病原體分離法、免疫學方法、基于核酸水平的PCR檢測方法。其中病原體分離方法是臨床診斷的金標準，但其存在耗時長，操作繁瑣等不足；免疫學方法也因為其非特異擴增和敏感性低等原因而沒有被廣泛使用；PCR檢測方法具有高特異性和敏感性，但其存在需要昂貴的實驗儀器和穩定的實驗環境、耗材成本高等缺陷、受限于檢測人員的操作技術等因素。

為了克服PCR擴增技術的劣勢，近年來發展了許多恒溫核酸擴增技術。該方法沒有模板變性、長時間溫度循環，即沒有調整溫度的過程，因此，不需要特定的昂貴設備。與傳統的核酸水平檢測方法相比具有簡便、快速、準確、廉價、易檢測等特點。目前已經廣泛應用于病原體的檢測，運用恒溫核酸擴增技術檢測結核分枝桿菌在臨床診斷技術發展中具有重大意義。但目前所采用的恒溫核酸擴增技術仍存在某些缺陷，如大多技術不能進行單管內的多重檢測，且在判讀時，有些恒溫熒光檢測方式是非特異的熒光檢測，這些缺陷影響了恒溫擴增核酸方式進行檢測的實用性。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供一種酶切探針恒溫檢測結核分枝桿菌核酸的試劑盒，所述試劑盒包括：檢測結核分枝桿菌IS6110基因等溫擴增引物和相應可被RNaseH酶切的探針；檢測結核分枝桿菌Pab基因的等溫擴增引物和相應可被RNaseH酶切的探針。

在一種實施方式中，所述檢測結核分枝桿菌IS6110基因等溫擴增引物SEQ?IDNO.1-SEQ?ID?NO.6和相應可被RNaseH酶切的探針是SEQ?ID?NO.7，該探針中包括一個RNA堿基，斜體下劃線所顯示的堿基為RNA堿基，

在一種實施方式中，所述檢測結核分枝桿菌Pab基因基因等溫擴增引物SEQ?IDNO.8-SEQ?ID?NO.13和相應可被RNaseH酶切的探針是SEQ?ID?NO.7，該探針中包括一個RNA堿基，斜體下劃線所顯示的堿基為RNA堿基，

在一種實施方式中，所述試劑盒還包括：檢測一段人工合成且與結核分枝桿菌核酸及人源核酸均非同源的內參基因等溫擴增引物SEQ?ID?NO.15-SEQ?ID?NO.20和相應可被RNaseH酶切探針SEQ?ID?NO.21，該探針中包括一個RNA堿基，斜體下劃線所顯示的堿基為RNA堿基

在一種實施方式中，結核分枝桿菌IS6110基因、檢測結核分枝桿菌Pab基因和內參基因各個基因檢測引物中IF:IB:LF:LB:OF:OR的使用比例為8:8:4:4:1:1，優選地，三個檢測基因的IF與IB引物的使用濃度為0.8μM，LF與LB引物的使用濃度為0.4μM，OF與OR引物的使用濃度為0.1μM。