[發(fā)明專利]鮑細胞培養(yǎng)基及鮑細胞培養(yǎng)方法

有效

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• 申請日: 2020-07-24
• 公開（公告）號: CN111876370B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發(fā)明（設計）人: 張文兵;劉家歡;潘明珠;馬碩利;黃冬;劉玥;郭衍林;麥康森
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種鮑細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，

選取健康的皺紋盤鮑個體，采用毛刷去除體表附著物，采用帶有紫外殺菌燈的循環(huán)水系統(tǒng)暫養(yǎng)待實驗的皺紋盤鮑24h；

取出待實驗的皺紋盤鮑，用75％酒精擦拭所述皺紋盤鮑的體表以去除腹足表面粘液，移入超凈工作臺中用無菌的解剖刀劃開皺紋盤鮑足肌取血，將取出的血液立即放入肝素鈉采血管中；

所述血液與鮑細胞培養(yǎng)基以體積比為1∶3的比例進行混合，將所述血液與鮑細胞培養(yǎng)基混合并搖勻后接種到多聚賴氨酸包被的六孔細胞培養(yǎng)板中，采用膜封口后置于培養(yǎng)箱中，每3d更換一次鮑細胞培養(yǎng)基，獲得血細胞；

還包括：

血細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板24h后，使用含有H₂O₂的鮑細胞培養(yǎng)基對血細胞進行ROS造模，加入DCFH-DA工作液孵育；

所述ROS造模的方法為：

將血細胞以10⁶每孔的密度接種到6孔細胞培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中，待24h后將鮑細胞培養(yǎng)基吸出，采用PBS沖洗后加入濃度為50mmol/L的H₂O₂的鮑細胞培養(yǎng)基；

1h后使用PBS緩慢沖洗3次，每孔加入含有50μmol/L DCFH-DA的工作液，置于培養(yǎng)箱中孵育20min；

孵育結束后吸出所述工作液，使用PBS緩慢沖洗3次，每孔中加入2ml鮑細胞培養(yǎng)基；

使用熒光顯微鏡在490nm激發(fā)波長處觀察細胞熒光；

所述多聚賴氨酸包被的六孔細胞培養(yǎng)板的制作方法為：

選取六孔的細胞培養(yǎng)板；

吸取400μl 0.01％多聚賴氨酸滴入孔中，均勻浸潤板底，30min后將多聚賴氨酸吸出，采用超純水對孔沖洗3次后，蓋上板蓋置于培養(yǎng)箱中備用；

其中，所述鮑細胞培養(yǎng)基組分為：L-15基礎培養(yǎng)基和混合血清，所述混合血清包括：占所述鮑細胞培養(yǎng)基體積15％的胎牛血清、占所述鮑細胞培養(yǎng)基體積5％的滅活鮑血清；

所述滅活鮑血清的制備方法為：

由皺紋盤鮑腹足部血竇取血；

將取出的血液離心，取上清液；

將所述上清液置于56℃水浴30min滅活；

對滅活后的清液采用過濾直徑為0.22μm的濾器過濾除菌，得到滅活鮑血清；

每100ml所述基礎培養(yǎng)基中添加以下終濃度的組分：1ml青霉素鏈霉素混合液100×、20mg慶大霉素、100μg兩性霉素B、2.02g NaCl、0.05g KCl、0.06g CaCl₂、0.1g MgSO₄、0.18gMgCl₂。

2.根據(jù)權利要求1所述的鮑細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，

所述鮑細胞培養(yǎng)基配置完成后，采用過濾直徑為0.22μm的過濾器過濾除菌備用。

3.根據(jù)權利要求1或2所述的鮑細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)箱中的溫度為17℃-25℃。

4.根據(jù)權利要求3所述的鮑細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，

所述培養(yǎng)箱中的溫度為22℃。

5.根據(jù)權利要求1所述的鮑細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，

所述循環(huán)水系統(tǒng)中的水為海水，所述海水中加入濃度為0.5mg/L聚維酮碘。