[發明專利]鮑細胞培養基及鮑細胞培養方法

有效

• 申請號: 202010728588.8
• 申請日: 2020-07-24
• 公開（公告）號: CN111876370B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 張文兵;劉家歡;潘明珠;馬碩利;黃冬;劉玥;郭衍林;麥康森
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種鮑細胞培養基及鮑細胞培養方法，鮑細胞培養基組分包括：L?15基礎培養基和混合血清，混合血清包括：占鮑細胞培養基體積15％的胎牛血清、占鮑細胞培養基體積5％的滅活鮑血清；基礎培養基中添加以下組分：青霉素鏈霉素混合液100×、慶大霉素、兩性霉素B、NaCl、KCl、CaCl₂、MgSO₄、MgCl₂。本發明對6孔細胞培養板表面進行多聚賴氨酸包被改良，調整了皺紋盤鮑血細胞原代培養的完全培養基配方，能夠在短時間內迅速獲得貼壁能力強，狀態穩定，活性良好的皺紋盤鮑血細胞。除此之外，本申請還能夠提供鮑細胞進行營養、免疫、環境毒性、基因功能分析等研究。

技術領域

本發明屬于動物細胞培養技術領域，具體涉及一種鮑細胞培養基及鮑細胞培養方法。

背景技術

皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai Ino)是我國重要的養殖貝類之一，近年來鮑養殖業發展迅速，但同時也面臨著由夏季高溫及病原引起的患病、死亡情況。針對皺紋盤鮑營養需求的研究方面，氨基酸、脂肪酸等營養物質的需求量及生理代謝研究上還有待深入。

鮑緩慢的生長速度以及較長的養殖周期限制了體內實驗的探索效率，且在體水平的實驗受到眾多環境因素影響，無法準確反映深層次的分子機理。因此，除了傳統的在體研究手段以外，目前亟需建立合適的模型為短期實驗提供一個便利條件。細胞水平研究的實驗周期短，組織特異性強，條件穩定。海洋無脊椎動物缺少特異性免疫，血細胞起到了重要的先天性免疫功能。血細胞培養作為高效，穩定的體外實驗模型，適合于細胞對環境毒物反應，營養素代謝等研究。因此，皺紋盤鮑的細胞培養有助于探究鮑高溫脅迫及病原生物的致病機理，為病原鑒定及疾病防治提供實驗模型，同時也有助于對鮑精準營養的研究，便于開展對營養素的感知、代謝等機制的探究，以及基因敲降，過表達等實驗的進行。

鮑血細胞的培養主要采用直接抽血貼壁法。但實驗發現，目前鮑血細胞的培養方式細胞活力較差，培養2d后血細胞便逐漸脫落，至第3d全部脫落不再生長，所培養的血細胞難以滿足實驗需求。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種鮑細胞培養基及鮑細胞培養方法，以解決現有技術中培養的鮑血細胞難以滿足實驗需求的問題。

為實現以上目的，本發明采用如下技術方案：一種鮑細胞培養基，所述鮑細胞培養基組分包括：L-15基礎培養基和混合血清，所述混合血清包括：占所述鮑細胞培養基體積15％的胎牛血清、占所述鮑細胞培養基體積5％的滅活鮑血清；

每100ml所述基礎培養基中添加以下終濃度的組分：1ml青霉素鏈霉素混合液100×、20mg慶大霉素、100μg兩性霉素B、2.02gNaCl、0.05g KCl、0.06g CaCl₂、0.1g MgSO₄、0.18g MgCl₂。

進一步的，所述滅活鮑血清的制備方法包括：

由皺紋盤鮑腹足部血竇取血；

將取出的血液離心，取上清液；

將所述上清液置于56℃水浴30min滅活；

對滅活后的清液采用過濾直徑為0.22μm的濾器過濾除菌，得到滅活鮑血清。

進一步的，所述鮑細胞培養基配置完成后，采用過濾直徑為0.22μm的過濾器過濾除菌備用。

本申請實施例提供一種鮑細胞培養方法，包括：選取健康的皺紋盤鮑個體，采用毛刷去除體表附著物，采用帶有紫外殺菌燈的循環水系統暫養待實驗的皺紋盤鮑24h；

取出待實驗的皺紋盤鮑，用75％酒精擦拭所述皺紋盤鮑的體表以去除腹足表面粘液，移入超凈工作臺中用無菌的解剖刀劃開皺紋盤鮑足肌取血，將取出的血液立即放入肝素鈉采血管中；