[發(fā)明專利]一種皺紋盤鮑鰓細(xì)胞的快速原代培養(yǎng)方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010728586.9
• 申請日: 2020-07-24
• 公開（公告）號(hào): CN111876369B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張文兵;潘明珠;劉家歡;馬碩利;劉玥;黃冬;郭衍林;麥康森
• 申請（專利權(quán)）人: 中國海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/07
• 分類號(hào): C12N5/07;C12P21/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及一種皺紋盤鮑鰓細(xì)胞的快速原代培養(yǎng)方法，包括如下步驟：對實(shí)驗(yàn)鮑魚進(jìn)行消毒處理；用滅菌的解剖工具將消毒處理后的實(shí)驗(yàn)鮑魚的鰓取出，放入無菌海水中清洗；取清洗后的鰓，將其剪成小段，放入含有0.1％的II型膠原酶的培養(yǎng)皿中消化30min；將消化完成的鰓加入含有血清的培養(yǎng)基中終止消化，并研磨后過100μm細(xì)胞篩，收集過篩液；將過篩液離心后，棄上清液后，用完全培養(yǎng)基重懸，收集上清液；將重懸后收集的上清液接到T25培養(yǎng)瓶中，在22℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。該方法可以滿足短時(shí)間獲得鮑的鰓細(xì)胞進(jìn)而進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的需要，解決鮑魚鰓組織中的細(xì)菌污染問題，以及解決使用胰蛋白酶酶解法對鰓組織進(jìn)行酶解會(huì)造成的鰓細(xì)胞活力下降問題。還公開了該方法的應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種皺紋盤鮑鰓細(xì)胞的快速原代培養(yǎng)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

皺紋盤鮑(Haliotis discus hanai)是我國海珍品的主要養(yǎng)殖品種，在分類學(xué)上屬于軟體動(dòng)物門、腹足綱、鮑科、鮑屬。鮑味道鮮美、營養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛，是我國北方的主要鮑魚養(yǎng)殖品種。目前，對皺紋盤鮑的研究主要集中在營養(yǎng)需求和免疫應(yīng)激上。然而，鮑的養(yǎng)殖周期較長，且鮑的殼上容易附著各種寄生蟲，對科學(xué)實(shí)驗(yàn)的開展增加了難度。為進(jìn)一步研究鮑的代謝和免疫的分子機(jī)理，亟需構(gòu)建一種鮑魚細(xì)胞的體外模型。

鰓是重要的免疫器官，培養(yǎng)鮑的鰓細(xì)胞為今后研究鮑魚的營養(yǎng)代謝和免疫研究奠定基礎(chǔ)。目前，鮑的鰓細(xì)胞的原代培養(yǎng)主要采用組織塊遷出法(Suwattana等，2010；崔龍波等，2000)，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，組織塊法中的皺紋盤鮑鰓組織，細(xì)胞遷出較慢，且鰓絲結(jié)構(gòu)復(fù)雜，徹底除菌較難，在遷出過程中容易造成細(xì)菌污染而使得培養(yǎng)失敗。而像其他物種組織一樣使用胰蛋白酶對鰓組織進(jìn)行酶解則會(huì)對鰓細(xì)胞活力造成很大損傷，造成培養(yǎng)細(xì)胞的成活率極低，難以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提供一種皺紋盤鮑鰓細(xì)胞的快速原代培養(yǎng)方法及應(yīng)用。

本發(fā)明一方面提供一種皺紋盤鮑鰓細(xì)胞的快速原代培養(yǎng)方法，該方法可以滿足短時(shí)間獲得鮑的鰓細(xì)胞進(jìn)而進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的需要，解決鮑魚鰓組織中的細(xì)菌污染問題，以及解決使用胰蛋白酶酶解法對鰓組織進(jìn)行酶解會(huì)造成的鰓細(xì)胞活力下降問題。

為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

一種皺紋盤鮑鰓細(xì)胞的快速原代培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

步驟一，選取活力較好的健康鮑魚作為實(shí)驗(yàn)鮑魚；

步驟二，對步驟一中的實(shí)驗(yàn)鮑魚進(jìn)行消毒處理；

步驟三，用滅菌的解剖工具將步驟二中消毒處理后的實(shí)驗(yàn)鮑魚的鰓取出，放入無菌海水中，在4℃的恒溫?fù)u床中以60rpm的轉(zhuǎn)速，清洗2h；

步驟四，取步驟三中清洗后的鰓，將其剪成5mm長的小段，放入含有0.1％的II型膠原酶的培養(yǎng)皿中消化30min；

步驟五，將步驟四中消化完成的鰓加入含有血清的培養(yǎng)基中終止消化，并研磨后過100μm細(xì)胞篩，收集過篩液；

步驟六，將步驟五中的過篩液采用的轉(zhuǎn)速為1000rpm，持續(xù)時(shí)間為2min離心后，棄上清液后，用完全培養(yǎng)基重懸，采用完全培養(yǎng)基重懸時(shí)，采用800rpm的轉(zhuǎn)速，離心5min，取上清；

步驟七，將重懸后收集的上清液接到T25培養(yǎng)瓶中，在17-25℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

優(yōu)選的，步驟二中對實(shí)驗(yàn)鮑魚進(jìn)行消毒處理的方法具體包括，用刷子把實(shí)驗(yàn)鮑魚體表刷洗干凈，用含消毒劑的無菌海水暫養(yǎng)實(shí)驗(yàn)鮑魚24h。

進(jìn)一步的，在暫養(yǎng)實(shí)驗(yàn)鮑魚的24h中，對無菌海水采用紫外消毒燈循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行滅菌處理。

需要說明的是，紫外消毒燈循環(huán)系統(tǒng)是將無菌海水抽放到一容器內(nèi)，采用紫外消毒燈進(jìn)行照射消毒，在實(shí)驗(yàn)中，無菌海水處于流動(dòng)的狀態(tài)。