[發明專利]一種皺紋盤鮑鰓細胞的快速原代培養方法及應用

有效

• 申請號: 202010728586.9
• 申請日: 2020-07-24
• 公開（公告）號: CN111876369B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發明（設計）人: 張文兵;潘明珠;劉家歡;馬碩利;劉玥;黃冬;郭衍林;麥康森
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07;C12P21/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種皺紋盤鮑鰓細胞的快速原代培養方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一，選取活力較好的健康鮑魚作為實驗鮑魚；

步驟二，對步驟一中的實驗鮑魚進行消毒處理；

步驟三，用滅菌的解剖工具將步驟二中消毒處理后的實驗鮑魚的鰓取出，放入無菌海水中，在4℃的恒溫搖床中以60rpm的轉速，清洗2h；

步驟四，取步驟三中清洗后的鰓，將其剪成5mm長的小段，放入含有0.1％的II型膠原酶的培養皿中消化30min；

步驟五，將步驟四中消化完成的鰓加入含有血清的培養基中終止消化，并研磨后過100μm細胞篩，收集過篩液；所述含有血清的培養基是在L15基礎培養基中添加血清，該血清中包含鮑魚滅活血清和胎牛血清；

步驟六，將步驟五中的過篩液采用的轉速為1000rpm，持續時間為2min離心后，棄上清液后，用完全培養基重懸，采用完全培養基重懸時，采用800rpm的轉速，離心5min，取上清，得到的細胞數量較多、呈圓形、活力較好；所述完全培養基是在L15基礎培養基中添加15％胎牛血清、5％的滅活鮑血清、20.2mg/ml的氯化鈉、0.54mg/ml的氯化鉀、0.6mg/ml的氯化鈣、1mg/ml的硫酸鎂、1.8mg/ml氯化鎂、100IU/ml青霉素、100μg/ml的鏈霉素、250μg/ml的慶大霉素、2μg/ml兩性霉素B，溶解后的培養基用0.22μm濾膜過濾除菌而成；

步驟七，將重懸后收集的上清液接到T25培養瓶中，在17-25℃培養箱進行培養。

2.根據權利要求1所述的皺紋盤鮑鰓細胞的快速原代培養方法，其特征在于，步驟二中對實驗鮑魚進行消毒處理的方法具體包括，用刷子把實驗鮑魚體表刷洗干凈，用含消毒劑的無菌海水暫養實驗鮑魚24h；在暫養實驗鮑魚的24h中，對無菌海水采用紫外消毒燈循環系統進行滅菌處理。

3.根據權利要求1所述的皺紋盤鮑鰓細胞的快速原代培養方法，其特征在于，在步驟三中，滅菌的解剖工具所采用的滅菌方法為將解剖工具放在高壓滅菌鍋中121℃、30min滅菌后烘干；在步驟三中用滅菌的解剖工具將步驟二中消毒處理后的實驗鮑魚的鰓取出之前，還需要在無菌工作臺中用75％的酒精將實驗鮑魚的體表擦拭干凈以對實驗鮑魚的體表進行消毒。

4.根據權利要求3所述的皺紋盤鮑鰓細胞的快速原代培養方法，其特征在于，步驟三中所述無菌海水采用天然海水用0.22μm過濾器過濾后，經高壓滅菌鍋121℃，30min高壓滅菌，經滅菌的海水中加入100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、250μg/ml慶大霉素和2μg/ml兩性霉素B而得到。

5.根據權利要求1所述的皺紋盤鮑鰓細胞的快速原代培養方法，其特征在于，所述鮑魚滅活血清的制備方法包括：選用皺紋盤鮑血竇進行取血，并在56℃溫度下水浴30min后，經0.22μm濾膜過濾、除菌制成。

6.根據權利要求1所述的皺紋盤鮑鰓細胞的快速原代培養方法，其特征在于，所述步驟七中，將重懸后收集的上清液接到T25培養瓶中，在22℃恒溫培養箱進行培養。