[發(fā)明專利]GhAOC4基因敲除創(chuàng)造棉花雄性不育和保持兩用系的方法

在審

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• 申請日: 2020-07-26
• 公開（公告）號: CN113980994A
• 公開（公告）日: 2022-01-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 閔玲;張獻(xiàn)龍;阿米爾;朱龍付
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/61;A01H5/00;A01H6/60;A01H1/02
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所(普通合伙) 42001
• 代理人: 張紅兵

本發(fā)明屬于作物分子育種領(lǐng)域，具體涉及GhAOC4基因敲除創(chuàng)造棉花雄性不育和保持兩用系的方法。特征為，分離一種棉花雄性不育性狀相關(guān)的基因片段SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，和作為分子標(biāo)記應(yīng)用的sgRNA1?guidRNA、sgRNA2?guidRNA序列，通過與CRISPR/Cas9系統(tǒng)和分子檢測后得到棉花雄性不育系。所述的基因通過轉(zhuǎn)基因后的表達(dá)被擾亂后，引起常溫下棉花雄性不育。通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得棉花基因編輯突變體，早期的花蕾噴施5×10^?4mol/L的茉莉酸甲酯溶液，可恢復(fù)突變體的雄性不育表型，通過自交擴(kuò)繁，得到包含突變體基因的具有雄性不育和保持特征的兩用系材料。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于作物分子育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及GhAOC4基因敲除創(chuàng)造棉花雄性不育和保持兩用系的方法。

背景技術(shù)

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，具有明顯的雜交優(yōu)勢。陸地棉品種間雜交種的強(qiáng)優(yōu)勢組合可增產(chǎn)20％～30％。在上個世紀(jì)90年代我國就培育出一大批抗蟲優(yōu)質(zhì)的常規(guī)雜交棉品種，例如中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所的培育的“中棉所”系列，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的的“華雜棉”系列，山東省棉花研究中心培育的“魯棉研”系列，湖南省棉花研究所培育的“湘雜棉”系列等等，這些品種在生產(chǎn)上都有大面積推廣應(yīng)用。在棉花雄性不育利用方面，細(xì)胞質(zhì)雄性不育系存在胞質(zhì)對產(chǎn)量有不利影響、育性恢復(fù)源狹窄而導(dǎo)致雜種優(yōu)勢不夠強(qiáng)等問題，因此未能實(shí)現(xiàn)大面積的推廣應(yīng)用。而生態(tài)敏感型雄性不育，在棉花中也鑒定了一系列，如：特棉S-1和中9106等。特棉S-1是溫敏不育系類型，材料在日平均溫度高于27℃生長時表現(xiàn)為不育(劉志等，2007)。馬建輝等將中040029材料通過航天誘變育種獲得了具有芽黃標(biāo)記的光敏雄性不育材料中9106，所得航天育種材料在光照周期為13至14.5小時的長日照條件下生長時表現(xiàn)為不育(馬建輝,2013)。雖然生態(tài)敏感型的雄性不育較穩(wěn)定，但由于環(huán)境復(fù)雜難以隨意控制，目前在棉花中進(jìn)行大規(guī)模制種還存在較大的問題和困難。相比而言，細(xì)胞核雄性不育系是棉花雜種優(yōu)勢利用的主要類型，目前棉花雜種優(yōu)勢主要利用的是洞A和ms5ms6兩種類型的細(xì)胞核雄性不育系。洞A細(xì)胞核不育系是四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院于1972年發(fā)現(xiàn)，隨后培育出“川雜”系列核不育雜交種，據(jù)報(bào)道雜種F1代一般可增產(chǎn)10％左右，是棉花雜種優(yōu)勢利用的優(yōu)良品系(唐雯，2008)。ms5ms6不育系由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所引進(jìn)，通過雜交和回交改良，培育出的中棉所38、南農(nóng)6號、南農(nóng)9號和南農(nóng)98-4等雜交棉品種(石雅麗等，2013)。但細(xì)胞核雄性不育系有一個致命的缺陷，就是不育系的繁種過程中存在50％的可育株，需要人工拔除，不僅增加了制種成本，而且往往由于可育株清除不徹底，降低了制種純度，增加了生產(chǎn)的風(fēng)險。因此創(chuàng)造出育性穩(wěn)定可靠的棉花雄性不育系且不育系繁種過程不存在50％的可育株，無需人工拔除，將給雜交棉的生產(chǎn)帶來歷史性突破。

現(xiàn)有的CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯在植物不育系的創(chuàng)制上已經(jīng)得到有效應(yīng)用。例如：Zhou等在水稻中創(chuàng)造了新的不含轉(zhuǎn)基因元件的TMS5溫敏不育系，建立了TMS5ab二元體，可用于水稻秈、粳兩個亞種的溫敏不育系快速培育(Zhou et al.2016)。Singh等對小麥Ms45的3個同源染色A、B和D的同源基因進(jìn)行CRISPR/Cas9編輯，得到三個同源位點(diǎn)同時突變的突變體，突變體表現(xiàn)為雄性不育(Singh et al.2018)。Chen等通過基因編輯技術(shù)，對玉米的育性相關(guān)基因MS8進(jìn)行了編輯，得到新的玉米雄性不育系(Chen et al.2018)。因此通過基因編輯技術(shù)創(chuàng)造棉花雄性不育系是一個便捷有效的手段。

到目前為止，尚未見到有關(guān)GhAOC4基因與棉花雄性育性有關(guān)的報(bào)道，也沒有利用該基因與CRISPR/Cas9系統(tǒng)在棉花中創(chuàng)制雄性不育系的報(bào)道，更沒有利用所述基因創(chuàng)制突變體實(shí)現(xiàn)棉花“一系兩用”創(chuàng)造棉花新種質(zhì)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服棉花現(xiàn)有雜交育種中細(xì)胞核雄性不育系繁種過程中存在50％的可育株，需要人工拔除的問題，提供一種創(chuàng)造棉花雄性不育和保持兩用系的方法，從而實(shí)現(xiàn)“一系兩用”創(chuàng)制棉花新種質(zhì)材料的目的。