[發明專利]GhAOC4基因敲除創造棉花雄性不育和保持兩用系的方法

在審

• 申請號: 202010726929.8
• 申請日: 2020-07-26
• 公開（公告）號: CN113980994A
• 公開（公告）日: 2022-01-28
• 發明（設計）人: 閔玲;張獻龍;阿米爾;朱龍付
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/61;A01H5/00;A01H6/60;A01H1/02
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 張紅兵

1.分離的與棉花雄性不育性狀相關的基因片段，其特征在于，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

2.一種分離的與棉花雄性不育性狀相關的基因片段的利用方法，其特征在于，通過如下制備步驟獲得如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的基因片段，所述的基因片段通過轉基因后的表達被擾亂后，引起常溫下棉花雄性不育，利用雄性不育材料作為不育系，進而創制棉花雄性不育系，得到雄性不育和保持兩用系的方法，所述的方法包括下列步驟：

(1)在陸地棉中篩選得到作為標記的GhAOC4基因的二個片段，其中第一個為片段被命名為Ghir_D08G004260.1，該片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；第二個片段被命名為Ghir_A08G004050.1，該片段核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，以上述兩個片段的保守區域設計共有靶位點，其中一個靶位點為sgRNA1，該靶位點核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；以特異區域設計只靶向Ghir_D08G004260.1基因的第二個共有靶位點sgRNA2，該靶位點的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

(2)利用重疊延伸PCR方法將sgRNA1-guidRNA、sgRNA2-guidRNA進行串連，然后通過一步克隆法構建到CRISPR/Cas9載體上，得到轉化載體GhU6.7::sgRNA1-sgRNA2，所述的轉化載體GhU6.7::sgRNA1-sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

(3)利用農桿菌介導的遺傳轉化方法將轉化載體GhU6.7::sgRNA1-sgRNA2轉入棉花，獲得棉花GhAOC4基因編輯突變體Ghaoc4，含有棉花GhAOC4基因編輯突變體Ghaoc4植株表現為雄性不育；

(4)將所獲的雄性不育植株Ghaoc4基礎上，對所得的Ghaoc4突變體處于發育早期的花蕾噴施5×10^-4mol/L的茉莉酸甲酯溶液，恢復Ghaoc4突變體的雄性不育表型，對雄性育性恢復的Ghaoc4突變體自交擴繁，使獲得的后代保持雄性不育，實現Ghaoc4突變體的雄性不育和保持兩用系材料。

3.一種由序列表SEQ ID NO：1所示的基因片段和/或SEQ ID NO：2所示的基因片段構建得到的的植物表達載體。

4.一種由如序列表SEQ ID NO：3和序SEQ ID NO：4所示的sgRNA1和/或sgRNA2序列構建得到的植物表達載體。

5.權利要求1所述的與棉花雄性不育性狀相關的基因片段在棉花雜交育種中的應用。

6.權利要求2所述利用Ghaoc4突變體培育兩用系的方法在棉花雜交育種中的應用。