[發明專利]檢測EGFR-T790M和EGFR-C797S順反式突變構型的方法和探針

有效

• 申請號: 202010726064.5
• 申請日: 2020-07-24
• 公開（公告）號: CN111662986B
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發明（設計）人: 唐東江;趙計昌;黃雅菁
• 申請（專利權）人: 珠海圣美生物診斷技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 北京超成律師事務所 11646
• 代理人: 高玉光

本發明提供了一種檢測EGFR?T790M和EGFR?C797S順反式突變構型的方法和探針，涉及基因檢測技術領域。該方法包括分別使用選擇性抑制T790野生型的探針和選擇性抑制C797野生型的探針體系對樣本進行PCR擴增，然后對各擴增產物進行測序，根據測序結果判定樣本中T790和C797的突變構型。上述方法能夠有效地區分T790M和C797S順反式突變構型，特異性非常高，可以直接給出樣本序列信息；同時還具有靈敏度高的優點，采用依次經偏向性擴增和非偏向性擴增的兩段式PCR擴增，再采用低成本的Sanger測序可以檢出低至0.1％的突變；NGS測序則可以在保障高靈敏度的同時通過降低測序深度降低成本。

技術領域

本發明涉及基因檢測技術領域，尤其是涉及一種檢測EGFR-T790M和EGFR-C797S順反式突變構型的方法和探針。

背景技術

EGFR突變主要發生在胞內酪氨酸激酶(TK)區域的前四個外顯子上(18～21)，目前發現的TK區域突變有30多種。其中外顯子20上的T790M和C797S突變是在腫瘤患者中發現的最棘手的基因突變類型。EGFR基因T790M具體是指表皮生長因子受體(epidermal growthfactor receptor，EGFR)第20號外顯子第790氨基酸位點由蘇氨酸(T) 突變為甲硫氨酸(G)，基因水平表現為c.2369CT；EGFR基因C797S具體是指EGFR 第20號外顯子第797氨基酸位點由半胱氨酸(C)突變為絲氨酸(S)，基因水平表現為 c.2389TA或c.2390GC。當T790M和C797S同時突變時，T790M和C797S位于同一條染色體上，這種構型稱為順式(為主要類型，占85％)；T790M和C797S位于不同染色體上，這種構型稱為反式，T790M和C797S順式基因突變和反式基因突變的示意圖如圖1所示。

TKI一直是EGFR突變型NSCLC靶向治療中的重要藥物，但是大多數具有敏感 EGFR突變的患者在第一代EGFR TKI治療9～13個月會出現耐藥性進展。在所有的耐藥機制中，EGFR T790M突變占40％～60％。第三代EGFR-TKI泰瑞沙/Tagrisso(又名奧希替尼/Osimertinib，AZD9291)是不可逆的選擇性TKI，可以有效應對T790M突變的新一代靶向藥物，為克服T790M繼發耐藥帶來了希望，但最終也會耐藥。使用奧西替尼大約11月之后，30％～40％會繼發EGFR C797S突變。

目前研究結果表明，T790M、C797S突變及不同構型與腫瘤患者的耐藥性、療效預測、預后極其相關，例如：當EGFR基因C797S和T790M為反式突變時，臨床上運用一代和三代EGFR-TKI聯合治療有效(如特羅凱聯合奧希替尼)。而當C797S和T790M 為順式突變時，腫瘤對所有一二三代EGFR-TKI均耐藥，參見表1。

表1

現有技術下，二代基因測序技術(NGS)是唯一的一種能夠直接給出序列信息來明確辨別C797S和T790M的順反式突變構型的高靈敏度高特異性檢測方法，而其他PCR 技術，如ARMS PCR或者數字PCR只能通過單點檢測的熒光信號間接推測突變構型，不能提供序列信息，無法對構型做出準確無爭議的直接判斷。然而，NGS技術雖具備通量大，精確度高和信息量豐富的特點，但用時長，實驗儀器和流程復雜，成本高，難以滿足所有病人的檢測需求。因此，目前仍然缺少一種檢測靈敏度高、檢測周期短、費用低，并且可以直接獲得T790M和C797S突變序列信息從而準確判斷順反式突變構型的方法和產品。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的第一目的在于提供一種檢測EGFR-T790M和EGFR-C797S順反式突變構型的方法，該方法至少能夠區分EGFR-T790M和EGFR-C797S為順式突變或反式突變。

本發明的第二目的在于提供分別用于阻斷擴增EGFR-T790野生型的探針和用于阻斷擴增EGFR-C797野生型的探針。