[發明專利]檢測EGFR-T790M和EGFR-C797S順反式突變構型的方法和探針

有效

• 申請號: 202010726064.5
• 申請日: 2020-07-24
• 公開（公告）號: CN111662986B
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發明（設計）人: 唐東江;趙計昌;黃雅菁
• 申請（專利權）人: 珠海圣美生物診斷技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 北京超成律師事務所 11646
• 代理人: 高玉光

1.一種非診斷和治療目的的檢測EGFR-T790M和EGFR-C797S順反式突變構型的方法，包括：

使用選擇性抑制EGFR-T790野生型擴增的PCR體系擴增樣本，得到第一擴增產物，所述選擇性抑制EGFR-T790野生型擴增的PCR體系含有用于阻斷擴增EGFR-T790野生型的探針；所述用于阻斷擴增EGFR-T790野生型的探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’-CACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTC-3’；

使用選擇性抑制EGFR-C797野生型擴增的PCR體系擴增樣本，得到第二擴增產物；所述選擇性抑制EGFR-C797野生型擴增的PCR體系含有用于阻斷擴增EGFR-C797野生型的探針；所述用于阻斷擴增EGFR-C797野生型的探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：5’-GCCCTTCGGCTGCCTCCT-3’；

分別對第一擴增產物和第二擴增產物進行測序，然后根據測序結果判定樣本中EGFR-T790M和EGFR-C797S的突變構型；

所示探針中加下劃線的核苷酸為鎖核酸修飾的核苷酸；

所述探針的3’末端經過雙脫氧修飾；

使用如下引物對對樣本進行PCR擴增：

SEQ ID NO.3：5’-TGGACAACCCCCACGTGT-3’；

SEQ ID NO.4：5’-AGCCAATATTGTCTTTGTGTTCC-3’；

PCR擴增為兩段式擴增，所述兩段式擴增包括先進行偏向性擴增，再進行非偏向性擴增；

所述偏向性擴增的退火延伸溫度為56℃，所述非偏向性擴增的退火溫度為56℃，延伸溫度為72℃。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述測序包括采用NGS測序或Sanger測序。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，按照如下方法判定樣本的突變構型：

若第一擴增產物和第二擴增產物中T790位點均為C，C797位點均為TG；則判定樣本為野生型；

若第一擴增產物中T790位點為T，C797位點為TG；第二擴增產物中T790位點為C，C797位點為TG；則判定樣本為T790M單點突變；

若第一擴增產物中T790位點為C，C797位點為TG；第二擴增產物中T790位點為C，C797位點為AG或TC，則判定樣本為C797S單點突變；

若第一擴增產物和第二擴增產物中T790位點均為T；第一擴增產物和第二擴增產物中C797位點同時為AG或同時為TC，則樣本為T790M和C797S順式突變；

若第一擴增產物中T790位點為T，C797位點為TG；第二擴增產物中T790位點為C，C797位點為AG或TC，則判定樣本為T790M和C797S反式突變。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，采用Sanger測序法對兩段式擴增的擴增產物進行測序。