[發明專利]基于酶輔助級聯循環擴增的發夾探針組及制備方法、用途

在審

• 申請號: 202010725811.3
• 申請日: 2020-07-24
• 公開（公告）號: CN111793622A
• 公開（公告）日: 2020-10-20
• 發明（設計）人: 吳昊;鄒霈;劉婭靈;王洪勇;吳軍;韓國慶
• 申請（專利權）人: 江蘇省原子醫學研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6844
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產權代理有限公司 11250
• 代理人: 謝楠

本發明涉及生化分析檢測領域，具體涉及基于酶輔助級聯循環擴增的發夾探針組及制備方法、用途，本發明提供的發夾探針組以待檢測的生物靶標作為一級靶標觸發第一重的靶標循環擴增，實現二級靶標序列的富集擴增。同時，二級靶標序列又能夠觸發第二重的靶標循環擴增，不斷釋放出熒光信號序列，實現了熒光信號序列的級聯循環擴增。采用上述的發夾探針組，僅痕量的生物靶標就可觸發產生大量的熒光信號序列，產生極強的熒光信號強度，顯著提高了生物靶標檢測的靈敏度，降低了檢測限。同時，上述探針結合生物靶標進行級聯循環擴增的特異性強，檢測結果準確。

技術領域

本發明涉及生化分析檢測領域，具體涉及一種基于酶輔助級聯循環擴增的發夾探針組、檢測體系、生物傳感器及制備方法、用途。

背景技術

目前，生化分析研究主要集中在對生物體、食品或環境中生物活性物質、重金屬、生物大分子(核酸、蛋白質、酶和多肽等)、生物藥物及微生物等的分析檢測。因此，生化分析檢測對疾病的預防診斷、環境監測、食品監控等具有十分重要的意義。通常，用于生化分析檢測的實際生化分析樣品中僅存在痕量靶物質，因此高靈敏度和高準確性一直是生化分析檢測方法的改進目標。

為了實現低濃度靶標物質的高靈敏檢測，人們引入了信號擴增技術來改善檢測方法的靈敏度和特異性。到目前為止，已經開發出了多種信號擴增策略，例如酶輔助靶標循環擴增、環介導等溫擴增、鏈置換擴增和滾環擴增等。在這些信號擴增策略中，基于工具酶(如聚合酶、連接酶、限制性內切酶、核酸外切酶、核糖核酸酶等)輔助的信號擴增策略，由于其具有操作簡便、靈敏度和特異性高、反應條件溫和、反應時間相對較短等優點，近年來在生化分析方面得到了飛速的發展。其中，利用核酸外切酶水解方式的差異性與納米技術、酶切循環效應、核酸適體技術、熒光染料探針標記技術等相結合發展而成的一系列核酸外切酶輔助信號擴增策略，已廣泛應用于核酸、蛋白質、離子和小分子等物質的檢測。

黃曲霉毒素(AFs)是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產生的雙呋喃環類毒素，廣泛存在于花生、玉米、水稻、小麥和堅果等農作物中?，F在已經發現的黃曲霉毒素有20多種，最為重要的是黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1和M2。其中以黃曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最大，其毒性是砒霜的68倍，氰化鉀的10倍，對肝臟組織的破壞性極強，是目前所知的最強的生物致癌劑。1993年，AFB1被世界衛生組織(WHO)的癌癥研究機構劃定為1類致癌物。許多國家都制定了法律法規來規范食品中AFB1的含量。例如，中國和美國對食品的監管限值為20ng/mL。歐盟規定的最高允許含量為大米5ng/mL，堅果和干果2ng/mL。在日本和韓國，允許的最大含量為1ng/mL。目前，國內廣泛采用高效液相色譜(HPLC)法檢測食品、藥品中AFB1的含量。HPLC法具有良好的靈敏度和高選擇性，但所需儀器設備昂貴、操作程序復雜，需要專業人員才能進行操作。因此，開發簡單、快速、高靈敏檢測AFB1的方法具有十分重要的意義。

發明內容

因此，本發明要解決的技術問題在于提供一種簡單、快速、高靈敏檢測黃曲霉毒素B1的基于酶輔助級聯循環擴增的發夾探針組、檢測體系、生物傳感器及制備方法、用途。

為此，本發明提供如下技術方案：

第一方面，本發明提供了一種基于酶輔助級聯循環擴增的發夾探針組，包括

第一發夾探針，所述第一發夾探針由5’端到3’端依次包括結合生物靶標的適體序列和第一結合序列，所述適體序列與所述第一結合序列的部分堿基配對使所述第一發夾探針形成發夾結構；

第二發夾探針，所述第二發夾探針由5’端到3’端依次包括第二結合序列和二級靶標序列，所述第二結合序列為所述第一結合序列的互補序列，所述第二結合序列與所述二級靶標序列的部分堿基配對使所述第二發夾探針形成發夾結構；