[發明專利]一種基于轉錄組測序的擴增基因全序列的方法

在審

• 申請號: 202010725593.3
• 申請日: 2020-07-24
• 公開（公告）號: CN112029761A
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發明（設計）人: 楊琳;張君誠;張杭穎
• 申請（專利權）人: 三明學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C40B50/06;C12Q1/6869;G16B30/10
• 代理公司: 廈門智慧呈睿知識產權代理事務所(普通合伙) 35222
• 代理人: 楊唯

本發明公開一種基于轉錄組測序的擴增基因全序列的方法，涉及擴增基因序列技術領域。本方法利用轉錄組建庫、測序、拼接、注釋后，獲得轉錄組序列信息，再通過相關物種基因的同源比對，獲取所需的基因序列，以獲取的基因序列為模板來設計引物，擴增目的基因條帶。本方法使用信息學的方法拼接得到目的基因序列全長，兩個引物都是基于基因已知片段設計，方法簡單，提高擴展效率，保證擴增序列的準確性，有助于推動未知序列擴增技術的發展。

技術領域

本發明涉及擴增基因序列技術領域，具體涉及一種基于轉錄組測序的擴增基因全序列的方法。

背景技術

擴增基因序列是探明基因功能的基礎。傳統的擴增未知基因序列的方法主要通過cDNA末端快速擴增技術(rapid amplification of cDNA ends，RACE)。它是一種基于PCR從低豐度的轉錄本中快速擴增cDNA的5'和3'末端的有效方法。其原理是利用mRNA的末端的特殊序列，設計含有接頭引物，與保守序列的特異引物擴增獲得未知序列，再進行拼接，得到基因全序列。

RACE技術需要使用到RNA末端的特殊引物，方法復雜。

發明內容

本發明的目的就是針對現有RACE技術存在的需要使用到RNA末端的特殊引物，方法復雜的不足，提供一種基于轉錄組測序的簡便快速獲得未知序列片段的新方法。本方法利用轉錄組建庫、測序、拼接、注釋后，獲得轉錄組序列信息，再通過相關物種基因的同源比對，獲取所需的基因序列。以獲取的基因序列為模板，設計引物，擴增目的基因條帶。該方法簡單方便，無需合成特殊引物，擴增效率高，準確性高，是未知序列擴增的有效方法。

本發明采用以下技術方案。

本發明提供一種基于轉錄組測序的擴增基因全序列的方法，利用轉錄組建庫、測序、拼接、注釋后，獲得轉錄組序列信息，再通過相關物種基因的同源比對，獲取所需的基因序列，以獲取的基因序列為模板來設計引物，擴增目的基因條帶。

進一步的，本發明的擴增基因全序列的方法包括以下步驟：

S1，用Trizol試劑或者RNAiso Plus試劑提取金線蓮總RNA；

S2，以提取的金線蓮總RNA為模板，以oligo(dT)18為逆轉錄引物，合成cDNA第一鏈；

S3，以cDNA第一鏈為模板，用cDNA第二鏈合成試劑盒(Second Strand cDNASynthesis Kit)合成cDNA第二鏈；

S4，對得到的cDNA第二鏈樣品，建立cDNA文庫，再進行總RNA測序，對測序數據過濾、組裝和去冗余后獲得金線蓮Unigene序列，對金線蓮Unigene序列進行功能注釋；

S5，獲取除金線蓮外的其他蘭科植物的基因序列，與獲得的金線蓮Unigene序列進行比對，獲取與所述其他蘭科植物的基因序列相同功能的金線蓮的基因序列，以所述金線蓮的基因序列為模板，設計引物并擴增得到目的基因。

優選地，步驟S1具體包括：

(1)取金線蓮植株，加液氮快速研磨成粉狀，取50～150mg裝入離心管，加入0.5～1.5mL RNAiso Plus，搖晃離心管使金線蓮粉狀樣品與RNAiso Plus充分混勻后，靜置5～15min；

(2)以10000～14000g的離心力，2～6℃條件下，離心5～15min，取離心后離心管中的上清液300～900μL，放置于新的離心管中；

(3)向放置上清液的試管中加入50～250μL氯仿，搖晃混勻，靜置5～15min；

(4)以10000～14000g離心力、2～6℃條件下，離心10～20min；