[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的擴(kuò)增基因全序列的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010725593.3
• 申請(qǐng)日: 2020-07-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112029761A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊琳;張君誠(chéng);張杭穎
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 三明學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/10;C40B50/06;C12Q1/6869;G16B30/10
• 代理公司: 廈門(mén)智慧呈睿知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 35222
• 代理人: 楊唯

1.一種基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的擴(kuò)增基因全序列的方法，其特征在于，利用轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)、測(cè)序、拼接、注釋后，獲得轉(zhuǎn)錄組序列信息，再通過(guò)相關(guān)物種基因的同源比對(duì)，獲取所需的基因序列，以獲取的基因序列為模板來(lái)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增目的基因條帶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的擴(kuò)增基因全序列的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1，用Trizol試劑或者RNAiso Plus試劑提取金線蓮總RNA；

S2，以提取的金線蓮總RNA為模板，以oligo(dT)18為逆轉(zhuǎn)錄引物，合成cDNA第一鏈；

S3，以cDNA第一鏈為模板，用cDNA第二鏈合成試劑盒合成cDNA第二鏈；

S4，對(duì)得到的cDNA第二鏈樣品，建立cDNA文庫(kù)，再進(jìn)行總RNA測(cè)序，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾、組裝和去冗余后獲得金線蓮Unigene序列，對(duì)金線蓮Unigene序列進(jìn)行功能注釋?zhuān)?/p>

S5，獲取除金線蓮?fù)獾钠渌m科植物的基因序列，與獲得的金線蓮Unigene序列進(jìn)行比對(duì)，獲取與所述其他蘭科植物的基因序列相同功能的金線蓮的基因序列，以所述金線蓮的基因序列為模板，設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增得到目的基因。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的擴(kuò)增基因全序列的方法，其特征在于，步驟S1具體包括：

(1)取金線蓮植株，加液氮快速研磨成粉狀，取50～150mg裝入離心管，加入0.5～1.5mLRNAiso Plus，搖晃離心管使金線蓮粉狀樣品與RNAiso Plus充分混勻后，靜置5～15min；

(2)以10000～14000g的離心力，2～6℃條件下，離心5～15min，取離心后離心管中的上清液300～900μL，放置于新的離心管中；

(3)向放置上清液的試管中加入50～250μL氯仿，搖晃混勻，靜置5～15min；

(4)以10000～14000g離心力、2～6℃條件下，離心10～20min；

(5)將上清液200～400μL轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入200～400μL異丙醇混勻，靜置5～15min；

(6)10000～14000g的離心力、2～6℃條件下，離心5～15min，吸棄離心管中的上清液，先后加入500～1000μL無(wú)水乙醇和100～400μL RNase-free水，混勻以洗滌RNA；以10000～14000g離心力、2～6℃條件下，離心10～20min，吸棄去上清液；

(7)重復(fù)步驟(6)；

(8)吸棄去上清的離心管于室溫中干燥5～30min，向干燥的離心管中加入20～40μL的RNase-free水，以溶解RNA；

(9)RNA溶解后，測(cè)定260和280nm吸光值，計(jì)算總RNA濃度和OD₂₆₀/OD₂₈₀值；并進(jìn)行電泳分離，檢測(cè)總RNA樣品質(zhì)。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的擴(kuò)增基因全序列的方法，其特征在于，步驟S2具體包括：

(1)取總RNA 0.5～1.5μg、dNTP Mixture0.5～1.5μL、oligo(dT)₁₈ 0.5～1.5μL和RNasefree ddH₂O 1～10μL，配制逆轉(zhuǎn)錄混合液I于離心管中；

(2)取5×PrimeScript^TM Buffer 3～5μL、DTT(100μmol/L)0.1～0.5μL、RNaseInhibitor0.1～1μL、PrimeScript^TM Reverse Transcriptase 0.5～1.5μL和RNase freeddH₂O 1～10μL，配制逆轉(zhuǎn)錄混合液II于另一離心管中；

(3)將逆轉(zhuǎn)錄混合液I在50～68℃溫浴3～8min后，冰浴1～3min；

(4)瞬時(shí)離心逆轉(zhuǎn)錄混合液I為2～15秒使液體混合液收集到離心管底部后，加入逆轉(zhuǎn)錄混合液II，瞬時(shí)離心2～15秒使液體混合液收集到離心管底部后30～50℃反應(yīng)30～60min；

(5)在78～85℃條件下反應(yīng)3～10min，使混合液中的酶液失活，得到cDNA第一鏈的樣品，-30℃～-10℃保存?zhèn)溆谩?/p>