[發明專利]桿狀病毒表達系統及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202010716613.0
• 申請日: 2020-07-23
• 公開（公告）號: CN111808884A
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發明（設計）人: 施金秀;羅燕;林映君;蒙偉能;葉知晟;藍田
• 申請（專利權）人: 云舟生物科技（廣州）有限公司
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N5/10;C12P21/00
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 戴志攀

本發明涉及一種桿狀病毒表達系統及其構建方法和應用，包括桿狀病毒穿梭載體、輔助載體和供體載體；所述桿狀病毒穿梭載體上含有Tn7靶位點和毒素蛋白基因表達盒；所述輔助載體上含有抗毒素蛋白基因表達盒，所述抗毒素蛋白能夠與所述毒素蛋白結合從而中和所述毒素蛋白的毒性，所述輔助載體和所述供體載體的復制子均為溫敏型復制子，所述供體載體包含轉座子Tn7的左右側翼序列。利用本發明的桿狀病毒表達系統，可快速直接地提取得到一種能夠直接用于下游桿狀病毒包裝的高純度無污染的重組陽性桿狀病毒載體。

技術領域

本發明涉及蛋白表達技術領域，特別是涉及一種桿狀病毒表達系統及其構建方法和應用。

背景技術

基于苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(Autographa californica multiplenuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)的昆蟲桿狀病毒表達載體系統(BaculovirusExpression Vector System,BEVS)是一種可在昆蟲細胞中大規模表達外源重組蛋白的最通用和最強大的真核表達系統之一，自1985年在該系統中首次實現IL-2蛋白的大規模生產以來便得到了廣泛的應用。與其他重組蛋白表達系統相比，重組桿狀病毒表達系統具有明顯的優勢：1)安全性高：宿主局限于特定的無脊椎動物，對哺乳動物和植物無致病性；2)易于擴大生產規模：可用初始得到的重組桿狀病毒感染更多的昆蟲細胞，從而獲得更高的病毒滴度；3)高水平及可溶性表達：可實現外源蛋白的高水平表達，在大多數情況下，重組蛋白是可溶的，且易于從感染細胞中純化回收；4)修飾及折疊的準確性：重組桿狀病毒載體可利用昆蟲細胞的翻譯后修飾系統對外源蛋白進行正確的修飾及折疊，從而得到具有生物活性的重組蛋白；5)懸浮培養：現有的細胞系在懸浮培養中生長良好，因此可在大規模生物反應器中生產重組蛋白；6)低成本：昆蟲細胞無血清培養大大降低了生產成本。

桿狀病毒穿梭載體系統是目前應用最廣泛的一種基于Tn7轉座的BEVS克隆系統，也被稱為Bac-to-Bac桿狀病毒表達載體系統。該系統包括三個主要成分：1)桿狀病毒穿梭載體，又稱為Bacmid載體，含有經修飾后攜帶lacZ基因的桿狀病毒基因組和插入lacZ基因編碼區的mini-attTn7位點，可在大腸桿菌中進行復制增殖；2)輔助載體pHelper，表達Tn7轉座酶；3)pFastBac供體載體，包含轉座位點Tn7R和Tn7L，以及兩者之間的慶大霉素抗性基因(Gen)表達盒和外源基因表達盒。Bacmid和輔助載體pHelper共存于DH10Bac菌株中，當克隆了外源基因的pFastBac轉化到DH10Bac菌株后，輔助載體pHelper表達的轉座酶可介導pFastBac載體上Tn7R和Tn7L的之間的區域轉座到Bacmid中的mini-attTn7位點，然后通過慶大霉素篩選和藍/白篩選鑒定出重組的陽性克隆。

但是，利用傳統的Bac-to-Bac桿狀病毒表達載體系統所得到的表達外源基因的Bacmid DNA是一種混合的質粒，其中包含了供體載體、輔助載體、未轉座的Bacmid載體以及重組陽性Bacmid載體。若直接用于轉染昆蟲細胞進行桿狀病毒包裝，污染質粒(供體載體和輔助載體)會以高達25％的非同源重組率整合到Bacmid病毒基因組中，引起病毒基因組的大片段缺失，并被包裝到子代病毒顆粒中。同時，這也不利于計算桿狀病毒包裝過程中Bacmid DNA的精確加入量，導致包裝體系非最優。雖然將轉座重組產物提純后重新電轉感受態能夠篩選得到純化的菌株，然而該過程操作繁瑣，耗時費力，大大降低了工作效率。

發明內容

基于此，有必要提供一種可快速直接得到高純度重組Bacmid載體的桿狀病毒表達系統。

一種桿狀病毒表達系統，包括桿狀病毒穿梭載體、輔助載體和供體載體；所述桿狀病毒穿梭載體上含有Tn7靶位點和毒素蛋白基因表達盒；所述輔助載體上含有抗毒素蛋白基因表達盒，所述抗毒素蛋白能夠與所述毒素蛋白結合從而中和所述毒素蛋白的毒性，所述輔助載體和所述供體載體的復制子均為溫敏型復制子；所述供體載體包含轉座子Tn7的左右側翼序列。