[發明專利]桿狀病毒表達系統及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202010716613.0
• 申請日: 2020-07-23
• 公開（公告）號: CN111808884A
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發明（設計）人: 施金秀;羅燕;林映君;蒙偉能;葉知晟;藍田
• 申請（專利權）人: 云舟生物科技（廣州）有限公司
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N5/10;C12P21/00
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 戴志攀

1.一種桿狀病毒表達系統，其特征在于，包括桿狀病毒穿梭載體、輔助載體和供體載體；所述桿狀病毒穿梭載體上含有Tn7靶位點和毒素蛋白基因表達盒；所述輔助載體上含有抗毒素蛋白基因表達盒，所述抗毒素蛋白能夠與所述毒素蛋白結合從而中和所述毒素蛋白的毒性；所述輔助載體和所述供體載體的復制子均為溫敏型復制子；所述供體載體包含轉座子Tn7的左右側翼序列。

2.根據權利要求1所述的桿狀病毒表達系統，其特征在于，所述溫敏型復制子為pSC101ori、pBBR1MCS2-Ts復制子或RK2復制子。

3.根據權利要求1所述的桿狀病毒表達系統，其特征在于，所述毒素蛋白選自RelE、MazF、ParE、Doc、YafQ、VapC、HicA、CcdB、Axe、YefM、RelJ、HigB和HipA中的一種，所述抗毒素蛋白對應地選自RelB、MazE、ParD、Phd、DinJ、VapB、HicB、CcdA、Txe、YoeB、RelK、HigA和HipB中的一種。

4.根據權利要求3所述的桿狀病毒表達系統，其特征在于，所述毒素蛋白為CcdB，所述抗毒素蛋白為CcdA。

5.根據權利要求1所述的桿狀病毒表達系統，其特征在于，所述桿狀病毒穿梭載體上還含有第一抗生素抗性基因，所述供體載體上還含有第二抗生素抗性基因。

6.根據權利要求5所述的桿狀病毒表達系統，其特征在于，所述第一抗生素抗性基因為卡那霉素抗性基因，所述第二抗生素抗性基因為慶大霉素抗性基因。

7.一種權利要求1～6任一項所述的桿狀病毒表達系統的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

提供Bacmid載體、pHelper載體和pFastBac載體；

將所述pHelper載體和所述pFastBac載體的復制子均替換為所述溫敏型復制子；

在所述pHelper載體中插入所述抗毒素蛋白基因表達盒；

將所述Bacmid載體上的LacZα片段替換為毒素蛋白基因表達盒。

8.權利要求1～6任一項所述的桿狀病毒表達系統在表達目的蛋白中的應用。

9.一種蛋白表達試劑盒，其特征在于，包括權利要求1～6任一項所述的桿狀病毒表達系統和感受態制備試劑。

10.一種目的蛋白的表達方法，其特征在于，包括以下步驟：

提供權利要求1～6任一項所述的桿狀病毒表達系統；

將目的蛋白的基因序列插入所述供體載體；

將所述桿狀病毒穿梭載體、所述輔助載體和含有所述目的蛋白的基因序列的所述供體載體轉化到細菌中，接種后在所述溫敏型復制子能夠復制的溫度條件下培養12～24小時；

挑取單克隆接種，然后在所述溫敏型復制子不能復制的溫度條件下培養12～24小時；

收集培養產物并進行質粒提取，然后轉染到昆蟲細胞中進行目的蛋白的表達。