[發(fā)明專利]一種體外培養(yǎng)HEK293細胞用于瞬時表達蛋白的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010716107.1
• 申請日: 2020-07-23
• 公開（公告）號: CN111826341A
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 肖志華
• 申請（專利權(quán)）人: 上海奧浦邁生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/073;C12P21/00;C07K16/00
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中;王永偉

本發(fā)明公開了一種體外培養(yǎng)HEK293用于瞬時表達蛋白的方法，包括如下步驟：S1：將凍存的HEK293細胞在原始培養(yǎng)基里復(fù)蘇，培養(yǎng)箱中孵育；S2：將細胞接種到HEK293無血清培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；S3：傳代操作；S4：再次傳代操作；S5：準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染質(zhì)粒；S6：獲取包括細胞密度和存活率的數(shù)據(jù)并稀釋細胞；S7：稀釋質(zhì)粒DNA；S8：稀釋轉(zhuǎn)染試劑；S9：將稀釋后的轉(zhuǎn)染試劑加到稀釋后的質(zhì)粒DNA中，將混合物在室溫下孵育；S10：將混合物緩慢添加至步驟S6的細胞中搖動；S11：放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，收獲HEK293細胞和表達產(chǎn)物。本發(fā)明可明顯提高表達量，表達效率高，在更短的時間獲得更多的蛋白。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，尤其涉及一種無血清HEK293培養(yǎng)基用于體外培養(yǎng)瞬時表達蛋白的方法。

背景技術(shù)

HEK293細胞是抗體和重組蛋白表達的重要平臺。根據(jù)表達的時間不同，可將基因產(chǎn)物表達分為瞬時表達與穩(wěn)定表達。穩(wěn)定表達是抗體藥物生產(chǎn)系統(tǒng)的金標(biāo)準(zhǔn)，不過其過程耗費時間長，費用高，不利于大通量、高效率地篩選新的抗體藥物。瞬時基因表達技術(shù)是指外源基因進入受體細胞后，存在于游離的載體上，不整合至染色體，較短時間內(nèi)就可獲得目的基因的表達產(chǎn)物，但隨著細胞的分裂增殖，這種外源基因最終會消失，表達持續(xù)時間為幾天到兩周。此技術(shù)大大縮短了微量至中等量重組抗體的生產(chǎn)過程，從而為抗體藥物的快速生產(chǎn)、早期篩選和功能、毒理分析提供有效的手段。

瞬時基因表達技術(shù)常用的宿主細胞有HEK293細胞、CHO細胞等，HEK293細胞具有生長速度快，易于轉(zhuǎn)染等優(yōu)點，在抗體藥物的快速高效表達和功能分析時，具有很好的優(yōu)勢。因而HEK293的瞬時表達已成為生物制藥企業(yè)常用技術(shù)平臺之一。不過瞬時表達雖然具有快速、簡便、易操作的特點，但是蛋白產(chǎn)量往往不太理想。目前，市場上缺乏一種利用無血清HEK293培養(yǎng)基用于體外培養(yǎng)高效瞬時表達蛋白的方法。另外，目前HEK293培養(yǎng)基市場為SIGMA、Invitrogen、Hyclone和Lonza等國際知名培養(yǎng)基占領(lǐng)，價格昂貴，每升高達上千元，不利于企業(yè)降低成本。故開發(fā)一種使用自主品牌且低成本的無血清無動物來源培養(yǎng)基進行HEK293高效瞬時表達的方法，對于抗體藥物的產(chǎn)業(yè)化的意義是非常重大的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種使用無血清HEK293培養(yǎng)基用于體外培養(yǎng)高效瞬時表達蛋白的方法。

為了解決現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：本發(fā)明的一種無血清HEK293培養(yǎng)基用于體外培養(yǎng)瞬時表達蛋白的方法，包括如下步驟：

S1：將凍存的HEK293細胞在原始培養(yǎng)基里復(fù)蘇，將HEK293細胞在37℃培養(yǎng)箱中孵育；

S2：當(dāng)細胞活率≥95％且生長處于對數(shù)中期時，開始進行馴化程序；

S3：每2-3天進行一次傳代操作，以保持HEK293細胞處于早期對數(shù)生長期，細胞接種密度為0.3～0.6×10⁶細胞/mL；

S4：當(dāng)細胞密度達到3～4×10⁶細胞/mL且細胞活率≥95％，2～4天時，再次傳代培養(yǎng)HEK293細胞；

S5：細胞密度達到約3～4×10⁶個活細胞/mL，活率≥95％時，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染前一天，將HEK293細胞按2～4×10⁶細胞/mL細胞密度接種，并使HEK293細胞生長過夜；

S6：在第二天(轉(zhuǎn)染當(dāng)天)，獲取包括細胞密度和存活率的數(shù)據(jù)，進行轉(zhuǎn)染的細胞活率應(yīng)≥95％，使用新鮮的培養(yǎng)基將細胞稀釋至2～4×10⁶細胞/mL；

S7：稀釋質(zhì)粒DNA，通過旋轉(zhuǎn)和/或翻轉(zhuǎn)混勻；

S8：將轉(zhuǎn)染試劑充分混勻，并用培養(yǎng)基稀釋轉(zhuǎn)染試劑，通過旋轉(zhuǎn)和/或翻轉(zhuǎn)來混合；