[發明專利]一種體外培養HEK293細胞用于瞬時表達蛋白的方法

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• 申請號: 202010716107.1
• 申請日: 2020-07-23
• 公開（公告）號: CN111826341A
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 肖志華
• 申請（專利權）人: 上海奧浦邁生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/073;C12P21/00;C07K16/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中;王永偉

1.一種體外培養HEK293細胞用于瞬時表達蛋白的方法，其特征在于包括如下步驟：

S1：將凍存的HEK293細胞在原始培養基里復蘇，將HEK293細胞在37℃培養箱中孵育；

S2：當HEK293細胞活率≥95％且生長處于對數中期時，開始進行馴化；

S3：每2-3天進行一次傳代操作，以保持HEK293細胞處于早期對數生長期，細胞接種密度為0.3～0.6×10⁶細胞/mL；

S4：當細胞密度達到3～4×10⁶細胞/mL且細胞活率≥95％，2～4天時，再次傳代培養HEK293細胞；

S5：細胞密度達到約3～4×10⁶個活細胞/mL，活率≥95％時，準備轉染質粒，轉染前一天，將HEK293細胞按2～4×10⁶細胞/mL的細胞密度接種，并使HEK293細胞生長過夜；

S6：在第二天，即轉染當天，獲取包括細胞密度和存活率的數據，進行轉染的HEK293細胞活率應≥95％，使用新鮮的培養基將HEK293細胞稀釋至2～4×10⁶細胞/mL；

S7：稀釋質粒DNA，通過旋轉和/或翻轉混勻；

S8：將轉染試劑充分混勻，并用培養基稀釋轉染試劑；

S9：將稀釋后的轉染試劑加到稀釋后的質粒DNA中，旋轉和/或顛倒或輕輕吹打2-3次進行混合，將混合物在室溫下孵育約20分鐘；

S10：將混合物緩慢添加至步驟S6的HEK293細胞中，在添加過程中輕輕搖動；

S11：放回37℃培養箱中培養，在轉染第二天，在瞬時表達過程中，維持葡萄糖濃度在4g/L以上，當細胞活率低于60％時收獲HEK293細胞和表達產物。

2.根據權利要求1所述的體外培養HEK293細胞用于瞬時表達蛋白的方法，其特征在于：在步驟S1中，所述的HEK293細胞的細胞數量為細胞數量1×10⁷。

3.根據權利要求1所述的體外培養HEK293細胞用于瞬時表達蛋白的方法，其特征在于：在步驟S1中，所述的培養箱中的轉速為125±5rpm，培養箱中CO₂濃度設置為8％。

4.根據權利要求1所述的體外培養HEK293細胞用于瞬時表達蛋白的方法，其特征在于：在步驟S7和步驟S8中，按照DNA：1～2mg/L；轉染試劑：2～4mg/L的轉染體系轉染質粒和轉染試劑。

5.根據權利要求1所述的體外培養HEK293細胞用于瞬時表達蛋白的方法，其特征在于：在步驟S11中，在轉染后16-22小時向HEK293細胞添加補料，在添加過程中輕輕晃動HEK293細胞，放回37℃培養箱。

6.根據權利要求1-5任一項所述的體外培養HEK293細胞用于瞬時表達蛋白的方法，其特征在于：所用的培養基為HEK293無血清培養基，所述的HEK293無血清培養基由如下組分組成：

7.根據權利要求1所述的體外培養HEK293細胞用于瞬時表達蛋白的方法，其特征在于：在日常傳代中，直接將HEK293細胞接種到HEK293無血清培養基中進行培養。

8.根據權利要求1-6任一項所述的體外培養HEK293細胞用于瞬時表達蛋白的方法，其特征在于：所述蛋白為抗體。

9.根據權利要求6所述的體外培養HEK293細胞用于瞬時表達蛋白的方法，其特征在于：所述抗體為CD20單抗、PD-1單抗；所述重組蛋白重組人凝血因子VIII。

10.根據權利要求6所述的體外培養HEK293細胞用于瞬時表達蛋白的方法，其特征在于：步驟S1-S11的順序可以變化。