[發(fā)明專利]用于改進(jìn)細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)RNA分離效率的RNA提取方法及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010713846.5
• 申請(qǐng)日: 2020-07-22
• 公開（公告）號(hào): CN111793620A
• 公開（公告）日: 2020-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾妮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 曾妮
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 張金銘

本發(fā)明提供了一種用于改進(jìn)細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)RNA分離效率的RNA提取方法及應(yīng)用，涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供的用于改進(jìn)細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)RNA分離效率的RNA提取方法，在進(jìn)行細(xì)胞裂解后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，當(dāng)死亡細(xì)胞占總細(xì)胞量的60?80％時(shí)停止裂解，然后再進(jìn)行后續(xù)的RNA提取操作。該方法通過統(tǒng)計(jì)死亡細(xì)胞數(shù)量占比，能夠掌握細(xì)胞裂解程度，從而有效防止細(xì)胞裂解過度或裂解不足，避免細(xì)胞膜裂解過度導(dǎo)致核膜裂解，胞質(zhì)RNA受到胞核RNA的污染的問題，或者由于裂解不足而使得提取到的胞質(zhì)RNA的量低于實(shí)際細(xì)胞質(zhì)中RNA的含量的問題，提高胞質(zhì)/胞核的分離效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及用于改進(jìn)細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)RNA分離效率的RNA提取方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

功能基因組學(xué)領(lǐng)域?qū)虮磉_(dá)分析最感興趣。現(xiàn)在人類基因組已經(jīng)完成測(cè)序，非常需要鑒定涉及疾病的基因和突變。這些基因可能是上調(diào)或下調(diào)基因，或者是多態(tài)性基因。用于分析這些基因的許多方法包括分離RNA。

目前常規(guī)RNA分離方法是由細(xì)胞分離總RNA。該方式分離的RNA包括胞質(zhì)的RNA和胞核的RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄之后用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法進(jìn)行定量和分析。這些方法中所使用的原料一直是細(xì)胞或組織樣品的總RNA或poly(A)+RNA。一方面這種方法無法滿足分別對(duì)定位于細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)的非編碼RNA的研究。同時(shí)，使用全細(xì)胞的總RNA時(shí)，結(jié)果是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以及胞質(zhì)降解產(chǎn)物的混合物。

其中，最傳統(tǒng)的細(xì)胞核/質(zhì)分離提取RNA方法(蔗糖密度梯度離心法)分兩步：(1)差速離心分離細(xì)胞器：在密度均一的介質(zhì)(如蔗糖)中由低速到高速逐級(jí)離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。由于各種細(xì)胞器在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，一般重復(fù)2～3次效果會(huì)好一些。差速離心只用于分離大小懸殊的細(xì)胞，更多用于分離細(xì)胞器。通過差速離心可將細(xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過密度梯離心再行分離純化。速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀。(2)核酸的分離純化。上述方法存在操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)、對(duì)離心機(jī)等硬件要求高的缺點(diǎn)，并且，梯度離心分離得到的各組分純度并不高。

此外，目前市面上已經(jīng)有的一些商品化的細(xì)胞核/質(zhì)分離試劑盒，例如Millipore及BioVision等公司的核/質(zhì)提取試劑盒，其操作過程有一步是離心之后吸取上清(胞質(zhì)成分)，沉淀為胞核成分，這一過程有可能因?yàn)闆]有吸取干凈上清導(dǎo)致胞核中有胞質(zhì)成的殘留導(dǎo)致分離徹底。同時(shí)，第一步裂解過程也可能因?yàn)椴煌?xì)胞的裂解時(shí)間不夠或者裂解過度導(dǎo)致胞質(zhì)/胞核的分離不純，導(dǎo)致分離效率不高。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的在于提供一種用于改進(jìn)細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)RNA分離效率的RNA提取方法，以至少緩解了現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。

本發(fā)明提供了一種用于改進(jìn)細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)RNA分離效率的RNA提取方法，所述提取方法包括：向細(xì)胞中加入胞膜裂解液后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，當(dāng)死亡細(xì)胞占總細(xì)胞量的60-80％時(shí)停止裂解，將裂解產(chǎn)物進(jìn)行核質(zhì)分離并分別提取RNA。

進(jìn)一步的，加入裂解液后每3-5分鐘進(jìn)行一次細(xì)胞計(jì)數(shù)，至死亡細(xì)胞占總細(xì)胞量的60-80％。

進(jìn)一步的，通過臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

進(jìn)一步的，將裂解產(chǎn)物通過過濾的方式，實(shí)現(xiàn)核質(zhì)成分分離；

優(yōu)選地，將裂解產(chǎn)物通過超細(xì)玻璃纖維膜過濾。

進(jìn)一步的，將裂解產(chǎn)物加入含有硅膠膜或超細(xì)玻璃纖維過濾柱的離心管中進(jìn)行過濾，實(shí)現(xiàn)核質(zhì)成分分離。

進(jìn)一步的，過濾后還包括清洗的步驟。

進(jìn)一步的，通過離心的方式進(jìn)行清洗；