[發明專利]一種高頻菜心離體組織培養方法

有效

• 申請號: 202010710176.1
• 申請日: 2020-07-22
• 公開（公告）號: CN111727885B
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發明（設計）人: 宋世威;梁雯雯;蘇蔚;郝彥偉;陳日遠;劉厚誠;孫光聞
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 佛山市君創知識產權代理事務所(普通合伙) 44675
• 代理人: 許菲菲

本發明涉及細胞工程應用領域，具體涉及一種高頻菜心離體組織培養方法。本發明將菜心種子經表面消毒后置于播種培養基上進行培養，得到苗齡為3～5d的無菌苗，然后在生長點上方平穩切下帶柄子葉作為外植體，垂直插入分化培養基中進行分化培養，獲得不定芽；將不定芽轉至生根培養基中進行生根培養，獲得組培苗；將組培苗開瓶煉苗，后續常規管理。本發明建立的菜心高頻再生體系不定芽再生率高，愈傷組織容易形成，污染率低，操作簡便，綜合性能高，為菜心遺傳轉化體系的建立奠定基礎。

技術領域

本發明涉及細胞工程應用領域，具體涉及一種高頻菜心離體組織培養方法。

背景技術

菜心(Brassica campestris L.ssp.chinensis var.utilis Tsen et Lee)為十字花科蕓薹屬白菜亞種的一個變種，是華南地區栽培面積和產量最大的蔬菜。菜心以菜薹為主要食用器官，品質柔嫩，風味獨特，營養豐富，受到廣大消費者的喜愛；其適應性廣，生長周期短，可供周年生產，在蔬菜供應中占有重要地位。

培育菜心抗病蟲和具有其他優良性狀的新品種迫切需要建立穩定高效的再生體系，以獲得優良的種質資源。這就需要選擇合適的外植體和適合外植體生長的培養基。此外，在培育過程中會受到自身及外界因素的影響：基因型不同的植物細胞其分化能力不一；相同基因型植物組織取材部位不一、苗齡不同，細胞分化能力也不相同；相同部位的植物組織細胞在不同配方的分化培養基中，分化能力不一。

攜帶AA基因型的白菜類作物屬于蕓薹屬再生率比較低的品種，其不定芽再生困難，農桿菌不易感染且侵染后細胞不易分化，影響了基因工程在白菜品種改良上的應用。隨著白菜全基因組測序計劃的完成，白菜開始成為十字花科植物功能基因組研究的模式植物。關于蕓薹屬植物基因和功能的研究越來越多，因此急需一個穩定且高效的菜心離體組織培養方法。

發明內容

為了克服現有技術的不足和缺點，本發明的目的在于提供一種高頻菜心離體組織培養方法。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種高頻菜心離體組織培養方法，包含如下步驟：

(1)將菜心種子經表面消毒后置于播種培養基上進行培養；

(2)選取步驟(1)培養苗齡為3～5d的無菌苗，在生長點上方平穩切下帶柄子葉作為外植體，垂直插入分化培養基中進行分化培養，獲得不定芽；

(3)將步驟(2)獲得的不定芽轉至生根培養基中進行生根培養，獲得組培苗；

(4)將步驟(3)獲得的組培苗開瓶煉苗，后續常規管理；

步驟(1)中所述的菜心的品種為“油綠501”、增城一號、60天甜菜心或碧清甜菜心；

步驟(1)中所述的表面消毒的具體操作優選為：

選取籽粒飽滿的菜心種子放入離心管中，依次用無菌水沖洗2遍、體積分數為75％的乙醇溶液浸泡2min、無菌水沖洗2遍、質量分數為7.5％的NaClO(活性氯含量為4％)浸泡10min，最后用無菌水沖洗三次并吸干水分；

步驟(2)中所述的無菌苗的最佳苗齡為3d；

步驟(2)中所述的分化培養基包含如下按終濃度計的組分：

MS+0.3mg/L NAA+5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+12g/L瓊脂+2mg/L AgNO₃，pH＝5.8；

步驟(2)中所述的帶柄子葉的子葉柄的長度優選為0.5cm；

步驟(2)中所述的分化培養的時間優選為40d；

步驟(3)中所述的不定芽的長度優選為1.0～2.0cm；