[發明專利]一種表達SARS-CoV-2 N蛋白的重組質粒、重組菌及構建方法和應用

在審

• 申請號: 202010706688.0
• 申請日: 2020-07-21
• 公開（公告）號: CN111778271A
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發明（設計）人: 梁建國
• 申請（專利權）人: 梁建國
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/50;C12N1/21;C07K14/165;C07K1/22;C12R1/19
• 代理公司: 北京勁創知識產權代理事務所(普通合伙) 11589
• 代理人: 張鐵蘭

本發明提供了一種表達SARS?CoV?2 N蛋白的重組質粒、重組菌及構建方法和應用，屬于疫苗技術領域，所述重組質粒以pET?N?GST?Thrombin?C?His為骨架質粒，插入有編碼SARS?CoV?2 N蛋白的基因的全長序列。本發明采用pET?N?GST?Thrombin?C?His表達載體表達SARS?CoV?2 N蛋白(新冠病毒核蛋白)，SARS?CoV?2 N蛋白的表達量高，且表達得到的SARS?CoV?2 N蛋白能夠保持良好的蛋白活性，進而能夠應用于多個免疫學檢測平臺，來輔助監控新冠病毒的感染和爆發。

技術領域

本發明屬于疫苗技術領域，尤其涉及一種表達SARS-CoV-2 N蛋白的重組質粒、重組菌及構建方法和應用。

背景技術

2019新型冠狀病毒(簡稱新冠病毒，英文名SARS-CoV-2)，也稱為嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)，是冠狀病毒科乙型冠狀病毒屬，嚴重急性呼吸道綜合征相關冠狀病毒種的一個分型，是具有包膜的正鏈單股RNA，它造成了于2019年底暴發的2019新型冠狀病毒感染的肺炎(COVID-19)。

新冠病毒病毒核衣殼內最重要的蛋白之一就是核衣殼蛋白(N蛋白)。N蛋白常作為冠狀病毒診斷檢測工具，是免疫學快速診斷試劑的核心原料。

目前，SARS-CoV-2 N蛋白用大腸桿菌表達獲得比較困難，這是由于將N蛋白的編碼序列克隆入一些表達載體后，常常發現其表達量符合要求，但是活性不夠甚至喪失。因此，本領域迫切需要開發新的高效表達N蛋白或其片段的技術，以便能夠大量生產供科研和診斷領域所需的N蛋白。

發明內容

本發明的目的在于提供一種表達SARS-CoV-2 N蛋白的重組質粒、重組菌及構建方法和應用，利用本發明的重組質粒表達獲得的SARS-CoV-2 N蛋白抗原性良好。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種表達SARS-CoV-2 N蛋白的重組質粒，所述重組質粒以pET-N-GST-Thrombin-C-His為骨架質粒，插入有編碼SARS-CoV-2 N蛋白的基因的全長序列；所述SARS-CoV-2 N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

優選的，所述編碼SARS-CoV-2 N蛋白的基因的全長序列在pET-N-GST-Thrombin-C-His上的插入位點為SalⅠ和XhoⅠa。

本發明提供了一種包括上述方案所述重組質粒的重組菌。

優選的，所述重組菌的原始菌包括大腸埃希菌BL21。

本發明還提供了上述方案所述重組菌的構建方法，包括以下步驟：

1)將所述編碼SARS-CoV-2 N蛋白的基因的全長序列插入到pMD-19T質粒上，得到擴增質粒；

2)以所述擴增質粒為模板，利用第一引物和第二引物進行PCR擴增，得到PCR產物；所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述第二引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；

3)對pET-N-GST-Thrombin-C-His質粒進行酶切，得到pET-N-GST-Thrombin-C-His線性質粒；

4)將所述pET-N-GST-Thrombin-C-His線性質粒和所述PCR產物連接，得到重組質粒；

5)將所述重組質粒轉入原始菌，得到表達SARS-CoV-2 N蛋白的重組菌；

所述步驟1)和步驟3)之間沒有時間順序限制。