[發明專利]一種表達SARS-CoV-2 N蛋白的重組質粒、重組菌及構建方法和應用

在審

• 申請號: 202010706688.0
• 申請日: 2020-07-21
• 公開（公告）號: CN111778271A
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發明（設計）人: 梁建國
• 申請（專利權）人: 梁建國
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/50;C12N1/21;C07K14/165;C07K1/22;C12R1/19
• 代理公司: 北京勁創知識產權代理事務所(普通合伙) 11589
• 代理人: 張鐵蘭

1.一種表達SARS-CoV-2N蛋白的重組質粒，所述重組質粒以pET-N-GST-Thrombin-C-His為骨架質粒，插入有編碼SARS-CoV-2N蛋白的基因的全長序列；所述SARS-CoV-2N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.根據權利要求1所述重組質粒，其特征在于，所述編碼SARS-CoV-2N蛋白的基因的全長序列在pET-N-GST-Thrombin-C-His上的插入位點為SalⅠ和XhoⅠa。

3.一種包括權利要求1或2所述重組質粒的重組菌。

4.根據權利要求3所述的重組菌，其特征在于，所述重組菌的原始菌包括大腸埃希菌BL21。

5.權利要求3或4所述重組菌的構建方法，包括以下步驟：

1)將所述編碼SARS-CoV-2N蛋白的基因的全長序列插入到pMD-19T質粒上，得到擴增質粒；

2)以所述擴增質粒為模板，利用第一引物和第二引物進行PCR擴增，得到PCR產物；所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

3)對pET-N-GST-Thrombin-C-His質粒進行酶切，得到pET-N-GST-Thrombin-C-His線性質粒；

4)將所述pET-N-GST-Thrombin-C-His線性質粒和所述PCR產物連接，得到重組質粒；

5)將所述重組質粒轉入原始菌，得到表達SARS-CoV-2N蛋白的重組菌；

所述步驟1)和步驟3)之間沒有時間順序限制。

6.根據權利要5所述的構建方法，其特征在于，步驟1)中利用pMD-19T載體中的T克隆位點將所述編碼SARS-CoV-2N蛋白的基因的全長序列進行TA連接插入。

7.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于，步驟2)中所述PCR擴增的程序為：98℃10sec，55℃15sec，72℃2min，循環數為35個；所述PCR擴增的體系以50μl計包括以下組分：1×PrimeSTAR Max Premix(2×)25μl、第一引物10pmol、第二引物10pmol、模板150ng和余量的滅菌蒸餾水；所述第一引物和第二引物的濃度分別為0.2μM。

8.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于，步驟4)中所述連接的體系以20μl計，包括以下組分：2×Seamless cloning Master Mix 10μl、pET-N-GST-Thrombin-C-His線性質粒2μl、PCR產物5μl和余量的滅菌蒸餾水；所述連接的程序為：50℃反應20min。

9.一種基于權利要求3或4所述重組菌或權利要求5～8任意一項所述構建方法得到的重組菌制備SARS-CoV-2N蛋白的方法，包括以下步驟：利用His標簽鎳柱提取和純化重組菌的培養發酵液中的SARS-CoV-2N蛋白。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述重組菌的培養發酵液的獲取方法包括：將所述重組菌接種于SOC液體培養基，于35～38℃條件下培養至菌液的光密度值為0.4～0.6，在菌液中加入終濃度為0.8～1.2mmol/L的IPTG，于18～22℃條件下誘導12～14h，得到重組菌培養發酵液。