[發明專利]用于COVID-19藥物篩選的慢病毒表達載體及其構建方法

在審

• 申請號: 202010700324.1
• 申請日: 2020-07-17
• 公開（公告）號: CN111793651A
• 公開（公告）日: 2020-10-20
• 發明（設計）人: 林彬;林澤斌;林先明;吳志明;王萍;孔維維;麥錦連;周麗詩
• 申請（專利權）人: 廣東源心再生醫學有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/65;C12N15/50;C12N5/10
• 代理公司: 佛山幫專知識產權代理事務所(普通合伙) 44387
• 代理人: 曾鳳云

1.一種用于COVID-19藥物篩選的慢病毒表達載體的構建方法，其特征在于，

是以pCW-Cas9-Blast為骨架載體，將nCoVN cDNA亞克隆到所述骨架載體中，構成新型冠狀病毒核衣殼蛋白的慢病毒表達載體pCW-Puro-T2A-nCoVN；

其中，所述nCoVN cDNA帶有一個6×his標簽和嘌呤霉素抗性基因。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)從pCW-Cas9質粒上擴增兩端帶有NheI和AvrII酶切位點的Puro-T2A片段；并對含有核衣殼蛋白序列的pUC57質粒的N蛋白基因全長序列進行擴增，得到N端帶有6×his標簽和NheI酶切位點，另一端帶有BamHI酶切位點的nCoVN片段；

(2)使用限制性內切酶NheI和AvrII對得到的Puro-T2A片段進行酶切，同時使用限制性內切酶NheI和BamHI分別對pCW-Cas9-Blast質粒和擴增得到的nCoVN片段進行酶切；

(3)經酶切后，得到Puro-T2A基因片段、nCoVN基因片段的雙酶切產物，pCW-Cas9-Blast質粒分為兩條約為7.4kb和4.3kb的片段，回收7.4kb的片段；

(4)使用T4連接酶將Puro-T2A和nCoVN基因片段連接到7.4kb的pCW-Cas9-Blast質粒片段上，獲得含有Puro-T2A-nCoVN基因的質粒pCW-Puro-T2A-nCoVN；

其中，所述步驟(1)中，兩個擴增的PCR反應體系為：

所述步驟(1)中，兩個擴增的PCR擴增程序為：

擴增用到的引物序列如下：

CoVN-6His-NheI-F：ttgctagccatcaccatcaccatcacatgtctgataatggacc；

CoVN-BamHI-R：agggatccttaggcctgagttgagtcagcactgc；

Puro-NheI-F：ttgctagcatggccaccgagtacaa；

T2A-AvrII-R：cctaggtgggccaggattct。

3.根據權利要求1或2所述的方法構建得到的用于COVID-19藥物篩選的慢病毒表達載體。