[發明專利]用于COVID-19藥物篩選的慢病毒表達載體及其構建方法

在審

• 申請號: 202010700324.1
• 申請日: 2020-07-17
• 公開（公告）號: CN111793651A
• 公開（公告）日: 2020-10-20
• 發明（設計）人: 林彬;林澤斌;林先明;吳志明;王萍;孔維維;麥錦連;周麗詩
• 申請（專利權）人: 廣東源心再生醫學有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/65;C12N15/50;C12N5/10
• 代理公司: 佛山幫專知識產權代理事務所(普通合伙) 44387
• 代理人: 曾鳳云

本發明公開了一種用于COVID?19藥物篩選的慢病毒表達載體的構建方法，其是以pCW?Cas9?Blast為骨架載體，將nCoVN cDNA亞克隆到所述骨架載體中，構成新型冠狀病毒核衣殼蛋白的慢病毒表達載體pCW?Puro?T2A?nCoVN；其中，所述nCoVN cDNA帶有一個6×his標簽和嘌呤霉素抗性基因。本發明所構建的用于COVID?19藥物篩選的慢病毒表達載體對實驗環境要求低，常規實驗室即可操作，可高通量操作，僅需2天即可構建載體并大量獲得。

技術領域

本發明涉及一種基于iPS的用于COVID-19藥物篩選的慢病毒表達載體及其構建方法。

背景技術

SARS-CoV-2為β屬冠狀病毒，與SARS-CoV基因組一致性為79％，有研究表明，其致病機理與SARS-CoV相似。目前許多關于SARS-CoV-2的研究都依賴于SARS-CoV的前期研究成果。參考SARS、MERS的致病機理，選擇合適的候選藥物進行檢測，能大大降低新藥研發周期長、成本高等風險。因此構建快速、準確的新型肺炎藥物篩選工具對目前嚴峻形勢下的疫情防控工作有重要意義。目前COVID-19藥物篩選常規細胞水平的研究方法是以SARS-CoV-2病毒毒株感染體外培養的哺乳動物細胞，但這種方法涉及病毒毒株的培養等實驗，存在安全風險，對實驗環境要求高，且不利于高通量篩選。

SARS-CoV基因組結構分析表明，其編碼蛋白主要包括刺突蛋白(spike protein,S)、核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N)、膜蛋白(membrane protein，M)、包膜蛋白(envelopeprotein，E)等。其中核衣殼蛋白(N)是SARS-CoV的主要結構蛋白，可以將病毒基因組包裹成螺旋狀的核糖核衣殼(RNP)，在病毒的自我組裝中起重要作用。研究表明，核衣殼蛋白可以調控細胞的分裂和增殖，抑制I型干擾素的產生，參與NF-КB、AP-1、TGF-β等信號通路。并且，核衣殼蛋白相對其他SARS-CoV蛋白有保守性高的特點。因此，核衣殼蛋白是冠狀病毒研究的理想工具。

發明內容

本發明所要解決的技術問題，就是提出一種用于COVID-19藥物篩選的慢病毒表達載體及其構建方法。

具體地，該慢病毒表達載體的構建方法是以pCW-Cas9-Blast(Addgene，83481)為骨架載體，將nCoVN cDNA(帶有一個6×his標簽和嘌呤霉素抗性基因)亞克隆到所述骨架載體中，構成新型冠狀病毒核衣殼蛋白的慢病毒表達載體pCW-Puro-T2A-nCoVN；利用慢病毒轉染技術將重組質粒轉入人誘導多能干細胞中，通過檢測nCoVN mRNA表達水平和免疫熒光染色，確定構建出能夠高表達nCoVN基因的慢病毒載體。

本發明所構建的用于COVID-19藥物篩選的慢病毒表達載體對實驗環境要求低，常規實驗室即可操作，可高通量操作，僅需2天即可構建載體并大量獲得。

附圖說明

圖1為Puro-T2A片段和nCoVN片段酶切后電泳圖，圖中：M：DNA Marker；1：Puro-T2A；2：nCoVN；

圖2為重組質粒載體pCW-Puro-T2A-nCoVN的結構示意圖；

圖3為Dox誘導nCoVN基因在iPS-nCoVN中表達；

圖4為免疫熒光染色，圖中6×His Tag為抗6×His Tag(綠色)抗體檢測細胞中的nCoVN蛋白表達情況，DAPI為用DAPI(藍色)對細胞核進行染色，比例尺為10um。

具體實施方式

下面將結合附圖說明和具體實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟、條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若無特別說明，實施例中所用的實驗方法均為本領域技術人員所熟知的常規方法和技術，試劑或材料均為通過商業途徑得到。