[發明專利]一種人膽管上皮細胞的制備方法及其培養基

有效

• 申請號: 202010699889.2
• 申請日: 2020-07-20
• 公開（公告）號: CN111979177B
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發明（設計）人: 劉佳
• 申請（專利權）人: 深圳市中佳生物醫療科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/074;C12N5/0775
• 代理公司: 深圳新創友知識產權代理有限公司 44223
• 代理人: 江耀純

本發明涉及一種人膽管上皮細胞的制備方法及其培養基，所述制備方法,包括如下步驟：S1、勻漿組織塊法分離出hCMSCs；S2、將hCMSCs體外定向分化為肝干細胞；S3、誘導肝干細胞向膽管上皮細胞分化。本發明通過體外誘導人絨毛膜間充質干細胞(hCMSCs)分化為膽管上皮細胞，為臨床制定膽道修復方案和人工膽管工程提供技術基礎。實驗證實，采用本發明的方法可制備具有膽管上皮細胞的生理功能的細胞。

技術領域

本發明屬于生物制藥技術領域，尤其涉及一種人膽管上皮細胞的制備方法、其培養基及其制備方法。

背景技術

在臨床上,膽道損傷的致傷原因繁雜，醫源性膽道損傷(Iatrogenic?Bile?DuctInjury,IBDI)在其中約占95％。醫源性膽道損傷是在腹部手術過程中或行膽道檢查時膽管受到的損傷，導致患者膽道的完整性、通暢性受到破壞。如膽道系統手術、胰腺、肝臟手術以及胃腸道手術等均有導致醫源性膽道損傷的可能，其中膽囊切除手術引起膽管損傷占80％以上。近年來，隨著腹腔鏡技術的巨大進步，目前LC是膽囊切除術的首選術式，卻不能有效地控制膽道損傷的發生率。一些研究報道腹腔鏡膽囊切除術BDI的發生率在0.4％到0.7％之間，大約三分之一的BDI在手術中被診斷出來，可以立即修復或重建，大多數BDI只在術后出現臨床癥狀才被發現，如腹痛、黃疸、膽汁性腹膜炎或休克。

膽管狹窄的主要原因是瘢痕的過度修復。國內外有關文獻報道，對于膽道瘢痕形成機制，可參照皮膚瘢痕愈合的發生機制，這種修復方式很容易導致膽管狹窄(BenignBiliary?Stricture,BBS)。隨后出現梗阻性黃疸、反復發作的膽管炎、肝內膽管結石、肝葉/肝段萎縮、膽汁性肝硬化、門靜脈高壓癥，甚至肝功能衰竭等嚴重并發癥，需要反復手術治療甚至肝移植，給患者及家庭帶來巨大壓力。因此，預防和治療損傷性膽管狹窄仍然是膽道外科中的重要問題，如何進行膽道損傷后膽管狹窄的治療是臨床亟須解決的問題。

盡管治療膽管損傷后狹窄的手段及用于修復膽管損傷的物質選擇較多，但均存在其有限性和弊端，尤其傳統外科吻合術，其術后并發癥較多，反復復發狹窄，故而繼續尋求一種創傷小、恢復快、再狹窄率低的方法迫在眉睫。如若能設計一種人工膽管可以代替膽管結構甚至功能，使膽管上皮細胞再生以修復損傷，是一種有發展潛力的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種人膽管上皮細胞的制備方法、其培養基及其制備方法，為臨床制定膽道修復方案和人工膽管工程提供技術基礎。

為此，本發明提出1、一種人膽管上皮細胞的制備方法,其特征在于包括如下步驟：S1、勻漿組織塊法分離出hCMSCs；S2、將hCMSCs體外定向分化為肝干細胞；S3、誘導肝干細胞向膽管上皮細胞分化。

在一些實施例中，還包括如下特征：

所述步驟1包括：選取足月胎兒的胎盤，機械剝離胎盤絨毛膜組織，PBS反復沖洗，將絨毛膜組織剪成0.8-1.2cm長條塊；用生理鹽水反復沖洗，去殘留血液，稱質量；勻漿至0.1-0.3cm³，生理鹽水洗；450-550r/min離心4-6min，去上清液，沉淀物按照每4-6g胎盤絨毛膜組織接種一個Φ100mm培養皿的份量接種于若干個培養皿，把培養皿倒置于飽和濕度、35-40℃、體積分數為4-6％CO₂的培養箱中0.8-1.2h。然后輕輕加入培養液進行體外培養：添加2-8ng/ml?bFGF的人無血清間充質干細胞培養基，置于35-40℃、4％-6％CO₂培養箱內培養，每2-4天全量換液一次，12～14天后細胞按常規方法傳代。