[發明專利]一種人膽管上皮細胞的制備方法及其培養基

有效

• 申請號: 202010699889.2
• 申請日: 2020-07-20
• 公開（公告）號: CN111979177B
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發明（設計）人: 劉佳
• 申請（專利權）人: 深圳市中佳生物醫療科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/074;C12N5/0775
• 代理公司: 深圳新創友知識產權代理有限公司 44223
• 代理人: 江耀純

1.一種人膽管上皮細胞的制備方法,其特征在于包括如下步驟：

S1、勻漿組織塊法分離出hCMSCs；

S2、將hCMSCs體外定向分化為肝干細胞；

S3、誘導肝干細胞向膽管上皮細胞分化。

2.如權利要求1所述的人膽管上皮細胞的制備方法,其特征在于，所述步驟S1包括：選取足月胎兒的胎盤，機械剝離胎盤絨毛膜組織，PBS反復沖洗，將絨毛膜組織剪成0.8-1.2cm長條塊；用生理鹽水反復沖洗，去殘留血液，稱質量；勻漿至0.1-0.3cm³，生理鹽水洗；450-550r/min離心4-6min，去上清液，沉淀物按照每4-6g胎盤絨毛膜組織接種一個Φ100mm培養皿的份量接種于若干個培養皿，把培養皿倒置于飽和濕度、35-40℃、體積分數為4-6％CO₂的培養箱中0.8-1.2h。然后輕輕加入培養液進行體外培養：添加2-8ng/ml?bFGF的人無血清間充質干細胞培養基，置于35-40℃、4％-6％CO₂培養箱內培養，每2-4天全量換液一次，12～14天后細胞按常規方法傳代。

3.如權利要求2所述的人膽管上皮細胞的制備方法,其特征在于，所述步驟S1和步驟S2之間還包括：hCMSCs接種于六孔板：選擇與六孔板相應的細胞爬片，置于濃硫酸中浸泡過夜，先用自來水沖洗干凈，置于無水酒精中浸泡5.5-6.5小時，然后用三蒸水沖洗2-4遍，放入鋁飯盒中烘干后高壓消毒備用；hCMSCs培養至第2代，0.1％-0.25％胰酶消化后計數并用培養基重懸。加細胞懸液前，根據玻片大小在每孔滴加少量培養基，使玻片與培養板底黏合在一起，然后以1-3×10⁴/cm²濃度接種。置于35-40℃、4-6％CO₂及飽和濕度培養箱中培養。

4.如權利要求1所述的人膽管上皮細胞的制備方法,其特征在于，所述步驟S2包括:待六孔板內細胞融合率達到65％-85％，PBS沖洗2-4遍，加入成肝干細胞培養基，每隔3～4天換一次液。

5.如權利要求1所述的人膽管上皮細胞的制備方法,其特征在于，所述成肝干細胞培養基包括：人無血清間充質干細胞培養基、0.5％-1.5％青鏈霉素混合液、b?FGF?5-15ng/ml、0.5-2％谷氨酰胺、1-10μg肝細胞生長因子。

6.如權利要求5所述的人膽管上皮細胞的制備方法,其特征在于，所述步驟S3包括：待上述六孔板的細胞呈卵圓形或多角形改變，棄舊培養基，PBS沖洗，加入成膽管上皮細胞培養基，每3～4天換一次液，顯微鏡下觀察細胞形態變化。

7.如權利要求6所述的人膽管上皮細胞的制備方法,其特征在于，所述成膽管上皮細胞培養基包括：人無血清間充質干細胞培養基、0.5％-1.5％青鏈霉素混合液、0.5％-2％谷氨酰胺、0.5-2％肝細胞生長因子、1-5％干細胞生長因子及1-10％表皮細胞生長因子。

8.一種成肝干細胞培養基，其特征在于，包括：人無血清間充質干細胞培養基、0.5％-1.5％青鏈霉素混合液、b?FGF?5-15ng/ml、0.5-2％谷氨酰胺、1-10μg肝細胞生長因子，所述成肝干細胞培養基用于誘導體外培養的骨髓間充質干細胞分化為肝干細胞。