[發(fā)明專(zhuān)利]一種角蛋白酶高效異源表達(dá)的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010698996.3
• 申請(qǐng)日: 2018-08-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111662908B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-08-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 龔勁松;史勁松;許正宏;蘇暢
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/113
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/113;C12N15/75;C12N1/21;C12N9/54
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發(fā)明公開(kāi)了一種角蛋白酶高效異源表達(dá)的方法，屬于工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明成功構(gòu)建了攜帶16種不同啟動(dòng)子序列的角蛋白酶重組菌，其中7種能夠提高角蛋白酶表達(dá)量，PaprE啟動(dòng)子改造重組菌的酶活水平最高，達(dá)到2605U/mL，相比對(duì)照菌提高20倍。在5L發(fā)酵罐上發(fā)酵液中角蛋白酶活力高達(dá)7176U/mL，是目前文獻(xiàn)報(bào)道重組角蛋白酶表達(dá)的最高水平，能更好地服務(wù)于實(shí)際應(yīng)用。本發(fā)明為角蛋白酶的高效表達(dá)及產(chǎn)酶研究提供了一種有效策略。傳統(tǒng)基因工程改造通常需構(gòu)建高通量篩選方法，進(jìn)行大量文庫(kù)篩選，工作量大、周期長(zhǎng)、成本高，該改造方法相比傳統(tǒng)方法極大的減小了工作量，提高了高表達(dá)效率。

本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮椋?01810933416.7，申請(qǐng)日為：2018年8月16日，申請(qǐng)名稱(chēng)為：一種角蛋白酶異源表達(dá)的啟動(dòng)子及其應(yīng)用的分案申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種角蛋白酶高效異源表達(dá)的方法，屬于工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

角蛋白是一種不溶性的結(jié)構(gòu)蛋白，因二硫鍵和氫鍵的高度交聯(lián)而具有高穩(wěn)定性。作為畜牧業(yè)、制革業(yè)和紡織業(yè)發(fā)展過(guò)程的副產(chǎn)品，每年均有大量的毛發(fā)棄置于自然界，對(duì)環(huán)境造成了巨大污染。目前，處理毛發(fā)主要通過(guò)高溫、高壓、酸、堿、氧化等物理化學(xué)方法進(jìn)行降解，但這些方法會(huì)損耗角蛋白中有用的氨基酸，并且效率低、能耗高、污染大。角蛋白酶通過(guò)二硫鍵還原作用打開(kāi)角蛋白中復(fù)雜的二硫鍵，進(jìn)而通過(guò)蛋白水解作用實(shí)現(xiàn)角蛋白的降解。采用角蛋白酶降解角蛋白是一種綠色的降解過(guò)程，從經(jīng)濟(jì)和環(huán)保的角度，這種對(duì)環(huán)境友好的生物處理方式具有廣闊的前景。

然而，總結(jié)已有研究來(lái)看，目前角蛋白酶的酶活及熱穩(wěn)定性普遍較差。雖然已有很多不同微生物來(lái)源的角蛋白酶基因成功實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)的文獻(xiàn)報(bào)道，但大部分基因工程菌的角蛋白酶表達(dá)水平一直未突破，使實(shí)現(xiàn)角蛋白酶的廣泛應(yīng)用及滿(mǎn)足工業(yè)化大規(guī)模使用需求成為難點(diǎn)。近年來(lái)研究人員逐漸把研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到角蛋白酶的異源高效表達(dá)上，基因工程改造手段是提高重組角蛋白酶表達(dá)水平的關(guān)鍵方法。Radha利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PxylA和PamyL實(shí)現(xiàn)了角蛋白酶在巨大芽孢桿菌中的高效表達(dá)，使重組酶的表達(dá)水平比對(duì)照菌高約3倍，酶活達(dá)到168.6U/mL(Radha S,et al.Bioresour Technol,2008,99:5528-5537)。Wang等人將多個(gè)拷貝數(shù)的角蛋白酶基因整合到地衣芽孢桿菌基因組上，構(gòu)建了能穩(wěn)定高產(chǎn)角蛋白酶的重組菌(Wang J J,et al.Biotechnol Bioeng,2004,87:459-464)。而通過(guò)啟動(dòng)子改造實(shí)現(xiàn)角蛋白酶的高效表達(dá)目前仍未見(jiàn)任何文獻(xiàn)報(bào)道，這對(duì)于對(duì)實(shí)現(xiàn)角蛋白酶的深入和廣泛應(yīng)用也具有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種角蛋白酶異源高效表達(dá)的啟動(dòng)子，提高角蛋白酶表達(dá)量和酶活。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子為角蛋白酶基因的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQID NO.13、SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述角蛋白酶基因的核苷酸序列為如SEQ IDNO.17、SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列，或與SEQ ID NO.17～19具有95％以上同源性的核苷酸序列。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種含有上述的啟動(dòng)子的表達(dá)載體。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述載體為適于芽孢桿菌表達(dá)的載體。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種表達(dá)角蛋白酶的重組菌，所述重組菌含有上述的啟動(dòng)子。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組菌的宿主包括但不限于枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、脆弱桿菌、克勞氏芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種上述重組菌的制備方法，包括如下步驟：