[發明專利]一種微生物降解植物甾醇生產雄二烯二酮的方法

在審

• 申請號: 202010698933.8
• 申請日: 2020-07-20
• 公開（公告）號: CN111808830A
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發明（設計）人: 張保國;劉相岑;袁辰陽;曹慧錦;杜桂林;史吉平
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海高等研究院
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/74;C12N1/21;C12P33/02;C12R1/32
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

本發明涉及生物技術領域，提供一種微生物降解植物甾醇生產雄二烯二酮的方法，首次從新金分支桿菌DSM 1381中克隆出一個新的3?甾酮?△¹?脫氫酶基因，過基因工程手段，獲得了高效表達3?甾酮?△¹?脫氫酶的重組菌，在轉化培養基中底物植物甾醇濃度高達5g/L時，可使轉化液中產物雄二烯二酮的純度在95％以上，有效的減少副產物雄烯二酮殘留，提高產物雄二烯二酮的純度。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是一種微生物降解植物甾醇生產雄二烯二酮的方法。

背景技術

甾體藥物(steroid hormone drugs)是指分子結構中含有甾體結構的激素類藥物，由于甾體母核上取代基、雙鍵位置或立體構型的不同，形成了種類繁多的甾體化合物，具有很強抗感染、抗過敏、抗病毒等作用，是臨床上一類重要的藥物，對機體起著非常重要的調節作用。甾體藥物主要分為鹽皮質激素、糖皮質激素、性激素和蛋白同化激素等。廣泛用于治療類風濕性關節炎、支氣管哮喘、乳腺癌、前列腺癌、口服避孕藥等各個方面，到目前為止，已獲得批準使用的甾體類藥物大約有300多種，是產量僅次于抗生素的第二大類藥物。

雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(androsta-1,4-diene-3,17-dione，簡稱雄二烯二酮、ADD)是重要的甾類藥物中間體，可用于雌性激素、口服避孕藥等藥物的合成。目前工業上生產ADD的方法是以AD為底物進行Δ¹脫氫，雖然這種方法轉化率高，反應時間短，但是AD價格昂貴導致ADD生產成本較高。植物甾醇是一種混合物，包括豆甾醇、Β-谷甾醇和菜油甾醇等，微溶于水，易溶于有機溶劑，具有甾體化學結構的基本特征且原料來源廣泛可再生，如今甾藥生產大多以植物甾醇為原料經微生物菌株如分枝桿菌等選擇性降解修飾后得到。這不僅解決了化學合成甾藥的污染問題，而且使自然資源得到了合理利用，并且極大的促進了甾體藥業的可持續發展。但是植物甾醇轉化生成ADD不僅底物投料量低，轉化速度慢，轉化率低，而且總會有副產物AD存在于產物當中。不僅降低了ADD的產率而且由于AD和ADD化學結構的高度相似性對下游產物的分離提純帶來了極大的困難，增加了生產成本。

3-甾酮-△¹-脫氫酶(3-ketosteroid-△¹-dehydrogenase，ksdd或kstd)，屬于黃素蛋白酶類，是甾體母核降解途徑中的的關鍵酶，可介導甾體母核A環上C_1,2之間氫鍵的形成，能夠成倍增加原有底物的抗炎活性及經濟價值。因此對ksdd酶基因的深入研究對整個甾體藥物行業的發展具有深遠意義。目前生產高附加值ADD的最直接有效的方法是以AD為底物，通過微生物產生3-甾酮-Δ¹-脫氫酶來實現AD到ADD的一步轉化。目前從已有的節桿菌(Arthrobacter)，諾卡氏菌(Nocardia sp.)、分支桿菌(Mycobacterium sp.)、紅球菌(Rhodococcus sp.)等微生物中克隆并鑒定了多個ksdd酶基因，并且將不同來源的ksdd酶基因進行了外源表達。專利CN106636160A公開了一種在大腸桿菌BL21中過表達新金分支桿菌ksdd的方法可以轉化AD為ADD，但是投料濃度僅為0.1％(W/V)，底物轉化率僅為76.5％。專利CN102703494A公開了一種利用重組枯草芽孢桿菌全細胞轉化AD生成ADD的方法，構建的基因工程菌株比對照菌株的酶活力顯著提高，但是以0.1％的AD為底物時，底物的摩爾轉化率也僅僅為65.7％。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種微生物降解植物甾醇生產雄二烯二酮的方法，用于解決現有技術中的問題。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明采用如下技術方案：

本發明的第一方面，提供一種3-甾酮-△¹-脫氫酶，所述3-甾酮-△¹-脫氫酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。