[發明專利]一種豬骨髓細胞源構建巨噬細胞庫的方法

在審

• 申請號: 202010694509.6
• 申請日: 2020-07-17
• 公開（公告）號: CN111808810A
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發明（設計）人: 高繼業
• 申請（專利權）人: 四川格瑞帝夫科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0786
• 分類號: C12N5/0786;C12N5/077
• 代理公司: 成都中絡智合知識產權代理有限公司 51300
• 代理人: 張潔;李永生

本發明屬于動物醫學領域，公開了一種豬骨髓細胞源構建巨噬細胞庫的方法，取豬骨髓處理獲取骨髓細胞，以存在不同誘導因子的培養基誘導骨髓細胞分化發育成具有M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞的細胞懸液。本發明構建了一種培養M1?和M2?極化豬巨噬細胞的新方法，該方法獲得的細胞與人單核細胞來源的M1?和M2?極化巨噬細胞有許多相似之處，無論是對于豬的免疫學研究，還是作為模型系統的人類醫學研究都是一個十分有價值的工具。

技術領域

本發明屬于動物醫學技術領域，具體涉及一種利用豬骨髓細胞源構建巨噬細胞庫的方法。

背景技術

在已發現并報到的病毒(如豬水泡性口炎病毒、豬圓環病毒、豬痘病毒、非洲豬瘟、典型豬瘟、豬腺病毒、豬水皰病病毒、PRRS、副流感)和細菌(如沙門氏菌、小腸結腸炎耶爾森菌、支原體肺炎，胸膜肺炎放線桿菌)病原體中，很多對豬具有極強的感染性，且都能在巨噬細胞內復制和/或顯著改變其基因表達。這些病原體除了給全球養豬業造成巨大的經濟損失外，很多都是人獸共患病原體，對人類健康造成潛在威脅。因此，關于家豬在抗病原體感染方面的免疫學研究已成為國際上廣泛關注的焦點。

此外，在生物醫學研究中，豬也越來越多地被選擇作為感染和炎癥研究的動物模型。其中原因有兩個：一是家豬與人類關系較小鼠更為密切，小鼠的免疫參數與人類免疫參數的相似性不到10％，而豬的免疫參數則有80％以上的重疊；二是豬巨噬細胞與人巨噬細胞極為相似，具有廣泛的模式識別受體，通過這些受體可以檢測病原體上的病原體相關分子模式。

但是由于缺乏包括巨噬細胞在內的天然免疫細胞的可靠和可重復的體外培養系統，且缺乏良好的標記物和其他工具，關于豬的免疫學研究一直受到限制。

因此，很明顯需要一個強大的可重復的巨噬細胞培養系統，該系統能夠提供具有良好特征的前炎性反應巨噬細胞(M1-polarized macrophages，M1)和/或抗炎性反應巨噬細胞(M2-polarized macrophages，M2)豬巨噬細胞。

發明內容

為了解決現有技術中獲得巨噬細胞效率較低且缺乏可靠的體外培養系統，本發明提供一種豬骨髓細胞源構建巨噬細胞庫的方法。

本發明所采用的技術方案為：

一種豬骨髓細胞源構建巨噬細胞庫的方法，取豬骨髓處理獲取骨髓細胞，以存在不同誘導因子的培養基誘導骨髓細胞分化形成具有M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞的細胞懸液。

進一步的，所述形成M1型巨噬細胞的誘導因子為豬GM-CSF刺激因子；

所述形成M2型巨噬細胞的誘導因子為鼠M-CSF刺激因子。

進一步的，將獲取到的豬骨髓細胞先置于液氮中冷凍保存，并在需要制備巨噬細胞庫時對冷凍保存的豬骨髓細胞進行復蘇處理。

因為骨髓細胞可以長時間保存在液氮中(可保存半年)，需要時可以取出進行誘導培養，獲得巨噬細胞，比傳統的現用現取更方便

進一步的，所述復蘇處理步驟具體如下：

S1.先將液氮中保存的豬骨髓細胞經過熱水浴處理，再轉移至預熱好的培養基溶液中室溫離心兩次；

S2.將離心后的細胞沉淀在預熱的培養基中懸浮并調節細胞濃度；

S3.將細胞轉移至細胞培養瓶中，并置于細胞培養箱中培養后備用。

進一步的，豬骨髓處理步驟具體如下：

Z1.取健康豬的肋骨和/或后肢股骨清洗后切去兩側末端；

Z2.采用含有抗凝劑的保護溶液從肋骨和/或后肢股骨的兩端切面沖洗骨髓并收集沖洗后的含有骨髓的溶液；

Z3.將含有骨髓的溶液過濾后得到濾過液，并將濾過液用緩沖劑配置溶液室溫下離心；