[發明專利]一種豬骨髓細胞源構建巨噬細胞庫的方法

在審

• 申請號: 202010694509.6
• 申請日: 2020-07-17
• 公開（公告）號: CN111808810A
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發明（設計）人: 高繼業
• 申請（專利權）人: 四川格瑞帝夫科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0786
• 分類號: C12N5/0786;C12N5/077
• 代理公司: 成都中絡智合知識產權代理有限公司 51300
• 代理人: 張潔;李永生

1.一種豬骨髓細胞源構建巨噬細胞庫的方法，其特征在于：

取豬骨髓處理獲取骨髓細胞，以存在不同誘導因子的培養基誘導骨髓細胞分化發育成具有M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞的細胞懸液。

2.根據權利要求1所述的一種豬骨髓細胞源構建巨噬細胞庫的方法，其特征在于：

所述形成M1型巨噬細胞的誘導因子為豬GM-CSF刺激因子；

所述形成M2型巨噬細胞的誘導因子為鼠M-CSF刺激因子。

3.根據權利要求1所述的一種利用豬骨髓細胞源構建巨噬細胞庫的制備方法，其特征在于：

將獲取到的豬骨髓細胞先置于液氮中冷凍保存，并在需要制備巨噬細胞庫時對冷凍保存的豬骨髓細胞進行復蘇處理。

4.根據權利要求3所述的一種豬骨髓細胞源構建巨噬細胞庫的方法，其特征在于：所述復蘇處理步驟具體如下：

S1.先將液氮中保存的豬骨髓細胞經過熱水浴處理，再轉移至預熱好的培養基溶液中室溫離心兩次；

S2.將離心后的細胞沉淀在預熱的培養基中懸浮并調節細胞濃度；

S3.將細胞轉移至細胞培養瓶中，并置于細胞培養箱中培養后備用。

5.根據權利要求1所述的一種豬骨髓細胞源構建巨噬細胞庫的方法，其特征在于：豬骨髓處理步驟具體如下：

Z1.取健康豬的肋骨和/或后肢股骨清洗后切去兩側末端；

Z2.采用含有抗凝劑的保護溶液從肋骨和/或后肢股骨的兩端切面沖洗骨髓并收集沖洗后的含有骨髓的溶液；

Z3.將含有骨髓的溶液過濾后得到濾過液，并將濾過液用緩沖劑配置溶液室溫下離心；

Z4.將離心后的細胞沉淀取出并采用預冷后的緩沖劑配置溶液在16℃以下的溫度條件進行至少兩次離心，將沉淀在細胞凍存液中懸浮，調整細胞濃度后置于液氮中保存。

6.根據權利要求5所述的一種豬骨髓細胞源構建巨噬細胞庫的方法，其特征在于：所述緩沖劑為PBS，其中物質的量濃度為0.15M，pH值為7.2；

所述細胞凍存液為具有10％-DMSO的FCS胎牛血清；

并在第一次離心中添加有Ficoll細胞分離液。

7.根據權利要求1-6任一項所述的一種豬骨髓細胞源構建巨噬細胞庫的方法，其特征在于：其中骨髓細胞的誘導分化步驟具體如下：

F1.將得到的豬骨髓細胞加入含有誘導因子的培養基中形成混合培養基；

F2.將混合培養基在細胞培養箱中培養5-7d，并在培養中期添加新鮮且同樣含有不同誘導因子的培養基；

F3.停止培養后用緩沖劑沖洗至少兩次并用含有EDTA的緩沖溶液靜置5-10min；

F4.用細胞刀刮取并收集細胞，將收集到的細胞用培養基溶液懸浮洗滌至少兩次，最后調整細胞濃度在細胞凍存液中懸浮并置于液氮中保存。

8.根據權利要求7所述的一種豬骨髓細胞源構建巨噬細胞庫的方法，其特征在于：所述培養基均為RPMI-1640培養基，其中具有10％的FCS和100U/ml的細胞雙抗混合液。

9.根據權利要求7所述的一種豬骨髓細胞源構建巨噬細胞庫的方法，其特征在于：所述細胞培養箱中的培養環境條件包括具有體積分數為5％的CO₂氣體環境條件和36-37℃的溫度環境條件。

10.根據權利要求7所述的一種豬骨髓細胞源構建巨噬細胞庫的方法，其特征在于：凍存時在細胞凍存液中的細胞濃度為2×10¹⁰/ml。