[發(fā)明專利]一種分子信標(biāo)、其構(gòu)建方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010694129.2
• 申請日: 2020-07-17
• 公開（公告）號: CN111856010B
• 公開（公告）日: 2023-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張志慶;劉娜娜;楊春天;王芳;張國棟;周亭;王秀鳳
• 申請（專利權(quán)）人: 中國石油大學(xué)（華東）;安丘市增塑劑廠
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573;G01N33/533;G01N33/574;G01N21/64
• 代理公司: 北京金信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11225
• 代理人: 李雪芹;徐琳

本發(fā)明提供一種分子信標(biāo)、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。所述分子信標(biāo)包括：兩條寡核苷酸鏈，其中，所述兩條寡核苷酸鏈中的一條為主鏈單鏈，其核苷酸序列包括：5’端連接序列、適配體序列以及3’端連接序列，所述主鏈單鏈在5’端和3’端分別標(biāo)記淬滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)，或者在5’端和3’端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)；另一條為互補(bǔ)短鏈cDNA，其無任何修飾基團(tuán)，所述互補(bǔ)短鏈cDNA包含與所述主鏈中的5’端連接序列的部分或全部互補(bǔ)的5’端互補(bǔ)序列、和與所述主鏈中的3’端連接序列的部分或全部互補(bǔ)的3’端互補(bǔ)序列，以使所述淬滅基團(tuán)和所述熒光基團(tuán)不分開。所述分子信標(biāo)在凝血酶的檢測中顯示出高靈敏性和靈活性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于分子檢測的分子信標(biāo)、其構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

凝血酶是血液中的多功能蛋白酶，在各種關(guān)鍵的生理和病理過程中起重要作用，例如凝血、血栓形成和血管生成。它可以將可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性纖維蛋白，在許多凝血相關(guān)反應(yīng)中形成纖維蛋白凝膠，其濃度的變化與某些疾病有關(guān)。雖然目前已經(jīng)開發(fā)了許多方法來檢測凝血酶，比如說電化學(xué)法、熒光法等，但這些方法大多數(shù)存在操作復(fù)雜，檢測靈敏度低等缺點(diǎn)，因此仍需要以高靈敏度和高選擇性檢測凝血酶的檢測試劑及檢測方法。

分子信標(biāo)(molecular?beacon,MB)自身能形成一個封閉的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，包括環(huán)狀區(qū)和莖干區(qū)，環(huán)狀區(qū)包含對靶標(biāo)的反義識別結(jié)構(gòu)域或者適配體序，MB序列末端分別標(biāo)記熒光劑和淬滅劑，在不存在靶標(biāo)的情況下，MB依賴于“閉合”構(gòu)型，導(dǎo)致熒光劑和淬滅劑之間發(fā)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)而淬滅。一旦當(dāng)MB和靶標(biāo)結(jié)合，就會使莖變性，并激活或改變信號。相對于傳統(tǒng)的DNA探針，分子信標(biāo)以操作簡單、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，在蛋白質(zhì)和多肽的檢測、mRNA監(jiān)測、活細(xì)胞實(shí)時成像等方面得到了廣泛應(yīng)用，特別是應(yīng)用于化學(xué)、生物和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中生物分子的識別檢測，在疾病診斷和治療領(lǐng)域中有著潛在的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種能簡便、快速、靈敏、特異性檢測的分子信標(biāo)。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種構(gòu)建上述分子信標(biāo)的方法。

本發(fā)明的再一個目的是提供上述分子信標(biāo)用于制備檢測試劑的用途。

本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用上述分子信標(biāo)檢測凝血酶的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種分子信標(biāo)，其包括：

兩條寡核苷酸鏈，

其中，

一條為主鏈單鏈(下文稱為主鏈SS)，其核苷酸序列包括：5’端連接序列、適配體序列以及3’端連接序列，所述主鏈SS在5’端和3’端分別標(biāo)記淬滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)或者在5’端和3’端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)；

另一條為互補(bǔ)短鏈cDNA，其無任何修飾基團(tuán)，所述互補(bǔ)短鏈cDNA包含與所述主鏈中的5’端連接序列的部分或全部互補(bǔ)的5’端互補(bǔ)序列、和與所述主鏈中的3’端連接序列的部分或全部互補(bǔ)的3’端互補(bǔ)序列，以使所述淬滅基團(tuán)和所述熒光基團(tuán)不分開。

在一個具體實(shí)施方式中，所述淬滅基團(tuán)為Dabcyl，所述熒光基團(tuán)為FAM，或者所述淬滅基團(tuán)為BHQ2，所述熒光基團(tuán)為Cy5。

在一個具體實(shí)施方式中，所述主鏈SS自身不能含有五個以上的堿基互補(bǔ)配對；所述互補(bǔ)短鏈cDNA自身不能含有五個以上的堿基互補(bǔ)配對。

在一個具體實(shí)施方式中，所述5’端連接序列可以選擇任意堿基，但不連續(xù)使用G堿基，這是因?yàn)檫B續(xù)的G堿基易形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，且長度不少于15個堿基，所述3’端連接序列可以選擇任意堿基，且長度不少于8個堿基；所述互補(bǔ)短鏈cDNA在主鏈SS的5’端和3’端與主鏈互補(bǔ)的堿基的個數(shù)分別不低于8個。