[發(fā)明專利]一種分子信標(biāo)、其構(gòu)建方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010694129.2
• 申請日: 2020-07-17
• 公開（公告）號: CN111856010B
• 公開（公告）日: 2023-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張志慶;劉娜娜;楊春天;王芳;張國棟;周亭;王秀鳳
• 申請（專利權(quán)）人: 中國石油大學(xué)（華東）;安丘市增塑劑廠
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573;G01N33/533;G01N33/574;G01N21/64
• 代理公司: 北京金信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11225
• 代理人: 李雪芹;徐琳

1.一種檢測凝血酶的方法，所述方法包括以下步驟：

1）檢測液的制備：將含分子信標(biāo)、Tris-HCl?pH=8.0、Na⁺、Mg²⁺的溶液置于離心管中，加入ddH₂O稀釋，然后將溶液混勻、離心，等量分裝至PCR離心管中進行梯度退火，

其中，所述分子信標(biāo)包括：

兩條寡核苷酸鏈，

其中，

所述兩條寡核苷酸鏈中的一條為主鏈單鏈，其核苷酸序列包括：5’?端連接序列、適配體序列以及3’?端連接序列，所述主鏈單鏈在?5’?端和?3’?端分別標(biāo)記淬滅基團和熒光基團或者在5’?端和?3’?端分別標(biāo)記熒光基團和淬滅基團，并且所述主鏈單鏈具有SEQ?IDNO.2的序列；

述兩條寡核苷酸鏈中的另一條為互補短鏈cDNA，其無任何修飾基團，所述互補短鏈cDNA包含與所述主鏈單鏈中的5’?端連接序列的部分或全部互補的5’?端互補序列、和與所述主鏈單鏈中的3’?端連接序列的部分或全部互補的3’?端互補序列，以使所述淬滅基團和所述熒光基團不分開其中，所述互補短鏈cDNA在主鏈單鏈的5’?端和3’?端與主鏈單鏈互補的堿基的個數(shù)分別不低于8個，并且所述短鏈cDNA具有SEQ?ID?NO.3或SEQ?ID?NO.4的序列；

2）線性方程的構(gòu)建：通過固定分子信標(biāo)的濃度，也即，體系中主鏈單鏈的最終濃度，改變凝血酶的濃度制備一系列溶液，用熒光分光光度計測定加入凝血酶前后的溶液在518nm熒光峰值強度，以凝血酶濃度x以及（F-F0）/F0構(gòu)建線性方程，其中凝血酶濃度x的單位為mol/L，F(xiàn)表示加入凝血酶的溶液在518nm的熒光峰值強度，F(xiàn)0表示未加凝血酶的溶液在518nm的熒光峰值強度；

3）凝血酶的測定：測定待測的凝血酶在518nm熒光峰值強度，并代入上述線性方程，計算得到凝血酶的濃度。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在步驟1）中，主鏈與短鏈cDNA的比例為1:1-1:10。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在步驟2）和步驟3）中，熒光分光光度計的激發(fā)波長設(shè)置為490nm，發(fā)射掃描范圍為500～600nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫分別為2.5nm和5nm，掃描速度是300nm/min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在步驟1）至步驟3）中，Mg²⁺的濃度為1-10mM。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在步驟1）至步驟3）中，Mg²⁺的濃度為5mM。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在步驟2）中，固定分子信標(biāo)的濃度為100nM，改變?nèi)薚hrombin濃度，37℃孵育30min，測定體系在518nm熒光峰值強度。

7.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，

所述淬滅基團為Dabcyl，所述熒光基團為FAM，或者

所述淬滅基團為BHQ2，所述熒光基團為Cy5。

8.一種分子信標(biāo)，所述分子信標(biāo)包括：

兩條寡核苷酸鏈，

其中，

所述兩條寡核苷酸鏈中的一條為主鏈單鏈，其核苷酸序列包括：5’?端連接序列、適配體序列以及3’?端連接序列，所述主鏈單鏈在?5’?端和?3’?端分別標(biāo)記淬滅基團和熒光基團或者在5’?端和?3’?端分別標(biāo)記熒光基團和淬滅基團，并且所述主鏈單鏈具有SEQ?IDNO.2的序列；

所述兩條寡核苷酸鏈中的另一條為互補短鏈cDNA，其無任何修飾基團，所述互補短鏈cDNA包含與所述主鏈單鏈中的5’?端連接序列的部分或全部互補的5’?端互補序列、和與所述主鏈單鏈中的3’?端連接序列的部分或全部互補的3’?端互補序列，以使所述淬滅基團和所述熒光基團不分開，并且所述短鏈cDNA具有SEQ?ID?NO.3或SEQ?ID?NO.4的序列。

9.?根據(jù)權(quán)利要求8所述的分子信標(biāo)，其中，

所述淬滅基團為Dabcyl，所述熒光基團為FAM，或者

所述淬滅基團為BHQ2，所述熒光基團為Cy5。