[發明專利]構建HBV轉基因小鼠模型的方法、組合物和應用

在審

• 申請號: 202010693599.7
• 申請日: 2020-07-17
• 公開（公告）號: CN111778288A
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發明（設計）人: 鄒淑香;謝水林;鄒芬;陳瑩瑩;黃黎珍;游凱欣;姚林敏
• 申請（專利權）人: 廣州華騰生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/51;A01K67/027
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 周文波

本發明公開了一種構建HBV轉基因小鼠模型的方法、組合物和應用，涉及生物技術領域。本發明公開的方法采用CRISP/Cas9系統在小鼠基因組Rosa26位點插入HBV表達盒；采用本發明的方法能夠獲得能持續穩定表達HBV的小鼠模型，其HBV基因插入在Rosa26位點，增加了HBV表達穩定性，同時采用小鼠白蛋白啟動子驅動表達，使外源HBV基因能在小鼠肝臟中定點表達，模擬HBV在人肝臟中持續感染表達的情況，該模型為研究HBV感染疾病和篩選相應治療藥物的篩選提供了可靠的模型基礎。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體而言，涉及一種構建HBV轉基因小鼠模型的方法、組合物和應用。

背景技術

目前，HBV相關的小鼠模型多采用HBV質粒水動力注射小鼠模型或AAV-HBV感染模型等。這些模型雖然制備過程較簡單，但由于均是瞬時感染，小鼠體內HBV表達水平不穩定，個體間差異較大，無法滿足長期觀察研究的需求。

此外，HBV轉基因小鼠模型也常采用原核顯微注射和基因打靶技術。原核顯微注射是將HBV DNA片段直接注入超排得到的受精卵的原核內，取注射存活的受精卵移植到假孕母鼠輸卵管，從而得到轉基因小鼠后代。基因打靶技術是通過同源重組將HBV基因插入ES細胞中，再通過囊胚注射將重組ES細胞注入囊胚并進行移植，從而獲得轉基因小鼠。

現有技術體系相對成熟，應用較廣泛。但顯微注射法小鼠的轉基因效率低，且HBV為隨機整合，易在后代遺傳過程中發生基因沉默或丟失。基因打靶法的轉基因小鼠陽性率高于顯微注射法，但受限于前期重組ES細胞的制備。

鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的目的在于提供一種構建HBV轉基因小鼠模型的方法、組合物和應用。本發明提供的方法可以獲得能持續穩定表達HBV的小鼠模型，其HBV基因插入在Rosa26位點，增加了HBV表達穩定性，同時采用小鼠白蛋白啟動子驅動表達，使外源HBV基因能在小鼠肝臟中定點表達，模擬HBV在人肝臟中持續感染表達的情況，該模型為研究HBV感染疾病和篩選相應治療藥物的篩選提供了可靠的模型基礎。

本發明是這樣實現的：

一方面，本發明提供一種構建HBV轉基因小鼠模型的方法，其采用CRISP/Cas9系統在小鼠基因組Rosa26位點插入HBV表達盒；其中，所述CRISP/Cas9系統所用的sgRNA的靶序列如SEQ ID NO.1-3任意一者所示，所述HBV表達盒包括由小鼠白蛋白啟動子驅動表達的HBV基因。

本發明提供的構建方法，通過采用CRISP/Cas9技術，使用具有更高編輯效率sgRNA，能實現HBV基因組的定點插入，且在Rosa26位點插入HBV表達盒，還增加HBV表達穩定性，此外，HBV基因由小鼠白蛋白啟動子驅動，使外源HBV基因能在小鼠肝臟中定點表達，模擬HBV在人肝臟中持續感染表達的情況，該模型為研究HBV感染疾病和篩選相應治療藥物的篩選提供了可靠的模型基礎。

在可選的實施方案中，所述HBV基因的堿基序列如SEQ ID NO.4所示或與其具有至少80％的同源性且編碼相同的蛋白。

在可選的實施方案中，所述CRISP/Cas9系統所用的同源臂的5’端同源臂堿基序列如SEQ ID NO.6所示，所述同源臂的3’端同源臂堿基序列如SEQ ID NO.7所示。

在可選的實施方案中，所述CRISP/Cas9系統包括Cas9蛋白。Cas9蛋白是本領域已知的蛋白，本領域技術人員容易根據實際需要選擇合適的Cas9蛋白。

在可選的實施方案中，所述方法包括：將所述CRISP/Cas9系統導入小鼠ES細胞；培育所述ES細胞使其發育成HBV轉基因小鼠。