[發(fā)明專利]一種短周期高效全雄中華鱉苗種的繁育方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010690852.3
• 申請日: 2020-07-17
• 公開（公告）號: CN111727934A
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張君;趙陽;史新坤;趙林斌
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: A01K67/02
• 分類號: A01K67/02;C12Q1/6888;C12Q1/6851
• 代理公司: 合肥和瑞知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 34118
• 代理人: 王挺

1.一種短周期高效全雄中華鱉苗種的繁育方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.鱉蛋控溫孵化：控制鱉蛋孵化溫室溫度為28±1℃；

S2.鱉蛋雌激素處理：對中華鱉胚胎孵化至15-18時期的鱉蛋，每個時期進(jìn)行一次藥物處理，所述藥物處理位置為最靠近胚胎的蛋殼面滴加雌二醇溶液；

S3.稚鱉溫室養(yǎng)殖：稚鱉出殼后約1周時間，將稚鱉轉(zhuǎn)移到溫室成鱉養(yǎng)殖水池，控制水池溫度32攝氏度并每日定時喂食至中華鱉性成熟。

S4.偽雌鱉篩選：設(shè)定一組中華鱉偽雌鱉性別鑒定引物對，包括一對目的基因18S rRNA和內(nèi)參基因Gapdh，采用熒光定量PCR反應(yīng)，利用性成熟的中華鱉表型雌鱉個體的目的基因18S rRNA在W和Z染色體上DNA拷貝數(shù)的不同將偽雌鱉篩選出來，所述目的基因18S rRNA和內(nèi)參基因Gapdh引物均包括F和R兩條引物，所述目的基因18S rRNA和內(nèi)參基因Gapdh的引物序列如下所示：

表一.引物序列

Table1.Perimer sequences

S5.親鱉塘繁育：將步驟S4鑒定出的偽雌鱉與雄鱉在親鱉塘繁殖得到子代全雄鱉。

2.如權(quán)利要求1所述的一種短周期高效全雄中華鱉苗種的繁育方法，其特征在于，所述步驟S1鱉蛋控溫孵化中鱉蛋放置在控溫房的孵化箱孵化，所述孵化箱底部預(yù)先鋪厚度為5cm的蛭石，調(diào)整鱉蛋的動物極向上放置，并在鱉蛋上覆蓋約1cm厚的蛭石，所述蛭石濕度在8-12％RH。

3.如權(quán)利要求1所述的一種快速全雄中華鱉苗種的繁殖方法，其特征在于：所述步驟S2中雌二醇溶液滴加劑量為5μL/次，滴加濃度為50μg/μL，所述雌二醇溶液采用95wt％乙醇為溶劑進(jìn)行配置。

4.如權(quán)利要求1所述的一種短周期高效全雄中華鱉苗種的繁育方法，其特征在于：所述步驟S2中中華鱉胚胎孵化時期采用胚胎發(fā)育形態(tài)特征判斷，所述15-18時期的胚胎發(fā)育形態(tài)變化特征如下：

5.如權(quán)利要求1所述的一種短周期高效全雄中華鱉苗種的繁育方法，其特征在于，所述步驟S4中每日定時喂食的時間為早9點和晚5點，每次飼料投喂量為當(dāng)前鱉體重的5-7％。

6.如權(quán)利要求1所述的一種短周期高效全雄中華鱉苗種的繁育方法，其特征在于，所述S4偽雌鱉篩選的具體步驟為：

S41、取50只以上確定性別為雄性的中華鱉血液DNA，每只個體采用20μL PCR反應(yīng)液體系設(shè)置一組反應(yīng)管，每組反應(yīng)管中分別加入目的基因18S rRNA和內(nèi)參基因Gapdh引物對，每個目的基因18S rRNA和內(nèi)參基因Gapdh做3個平行重復(fù)孔，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，計算目的基因18S rRNA相對拷貝數(shù)；

S42、從步驟S41的雄性中華鱉中選取一只作為對照樣本A，設(shè)定對照樣本A的18S rRNA相對拷貝數(shù)為1，計算其他雄性中華鱉個體18S rRNA相對拷貝數(shù)相比于A的相對值，得到所有雄性中華鱉18S rRNA相對拷貝數(shù)的相對值，求所有雄鱉相對值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差SD，以作為閾值；

S43、挑選溫室成鱉養(yǎng)殖池中性成熟中華鱉的雌鱉個體，提取血液DNA，以步驟S41中方式進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，得到每只表型雌鱉的目的基因18S rRNA相對拷貝數(shù)，計算每只表型雌鱉的相對拷貝數(shù)相對步驟S2中對照樣本A的相對拷貝數(shù)的相對值Y；

S44、將步驟S43計算的相對值Y與步驟S42設(shè)定的閾值進(jìn)行比較，如則為雌鱉，則為偽雌鱉。

7.如權(quán)利要求6所述的一種快速全雄中華鱉苗種的繁育方法，其特征在于，所述步驟S41中所述20μL PCR反應(yīng)液體系為：

8.如權(quán)利要求6或7所述的一種短周期高效全雄中華鱉苗種的繁育方法，其特征在于，所述步驟S41中所述熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：