[發(fā)明專利]一種微孔載體檢測抑制物的測定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010690586.4
• 申請日: 2020-07-07
• 公開（公告）號: CN111808913B
• 公開（公告）日: 2023-03-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張容博;張君成;王忠文;張正淳
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西大學
• 主分類號: C12Q1/20
• 分類號: C12Q1/20
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種微孔載體檢測抑制物的測定方法，在微孔板的微孔內(nèi)注入40μl的瓊脂培養(yǎng)基制成微孔載體，在微孔載體上載入藥物樣品以及病原菌孢子，檢測藥物對孢子萌發(fā)的抑制作用，測定方法的步驟如下：1)用微孔板制備合格的微孔載體；2)將待測樣品載入微孔載體；3)將病原菌孢子載入微孔載體；4)孢子萌發(fā)培養(yǎng)；5)結(jié)果觀測。本發(fā)明的優(yōu)點：1)一塊常規(guī)微孔板可以制備96個微孔載體，可以實現(xiàn)測試體系微型化；2)一個測試單元只消耗樣品液10μl，實現(xiàn)檢測樣本微量化。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物病理學技術(shù)，具體是一種微孔載體檢測抑制物的測定方法。

技術(shù)背景

當前及今后相當長時期內(nèi)，農(nóng)藥防治仍是植物病害防治的主要手段。探索和挖掘生物源農(nóng)藥是農(nóng)藥防治的重要方向，而生物源農(nóng)藥的早期探索挖掘往往要從自然界中采集或收集對植物病原菌具有抑制作用的物質(zhì)，或者從生物體或生物產(chǎn)品中分離具有抑制作用的活性成分。顯然，高效可行的抑制物識別檢測手段將有利于提高生物源農(nóng)藥探索挖掘的成效和效率。當前識別抑制物對病原菌作用的常用方法包括利用瓊脂培養(yǎng)基平板的測定方法，該測定方法的主要技術(shù)思想是，利用普通平皿制備含藥培養(yǎng)平板，再接種入病原菌，然后培養(yǎng)觀察藥物對病原菌的抑制作用。該測定技術(shù)方案要求待測樣本的樣品量比較大，樣品量過少時往往無法檢測，容易錯過或遺漏含量少的抑制活性物。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用微孔載體技術(shù)檢測有關(guān)物質(zhì)對孢子萌發(fā)的抑制作用的測定方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：

一種微孔載體檢測抑制物的測定方法，主要技術(shù)是在微孔板的微孔內(nèi)注入40μl的瓊脂培養(yǎng)基制成微孔載體，在微孔載體上載入藥物樣品以及病原菌孢子，檢測藥物對孢子萌發(fā)的抑制作用，測定方法的步驟如下：

1.用微孔板制備合格的微孔載體

1)微孔板的卡穩(wěn)：準備一個能將微孔板卡穩(wěn)及平置的、表面潔凈的卡穩(wěn)工具，轉(zhuǎn)入無菌工作臺，將潔凈的微孔板卡于卡穩(wěn)工具上。

2)瓊脂培養(yǎng)基的熔化：取病原菌孢子萌發(fā)適用的用三角瓶盛裝的瓊脂培養(yǎng)基加熱熔化。

3)培養(yǎng)基的80℃處置：預先將普通水浴鍋加熱恒溫到80℃，將操作2)熔化的培養(yǎng)基放入該水浴鍋中，平衡至80℃。

4)移液槍無泡移液的處置：把操作3)平衡至80℃的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌工作臺，把移液槍取液量調(diào)到40μl，將槍頭伸入80℃的培養(yǎng)基中反復吸排培養(yǎng)基，直至排液操作不出現(xiàn)氣泡現(xiàn)象。

5)微孔載體的制備：操作4)無氣泡現(xiàn)象后，過量按下移液槍吸取培養(yǎng)基，提起槍頭并靠貼在三角瓶瓶口壁上脫除槍頭外部粘附的培養(yǎng)基，再轉(zhuǎn)移到微孔板的微孔內(nèi)，注入40μl培養(yǎng)基到微孔底部，并將槍頭留在培養(yǎng)基液內(nèi)作環(huán)轉(zhuǎn)移動，引導培養(yǎng)基均勻分布于微孔底面，冷卻后形成一個瓊脂培養(yǎng)基的微小平板，作為測試工作用的微孔載體。在注完一個微孔后，母指按住移液槍，返回移到80℃三角瓶培養(yǎng)基中，同樣的吸液操作注制下一個微孔載體，連續(xù)操作直到注制的微孔載體數(shù)量達到測試需要的數(shù)量。

6)合格微孔載體的標識：將操作5)注制完畢的微孔板從卡穩(wěn)工具中取出，在微孔板下方放置一個直線工具，反轉(zhuǎn)微孔板，把板的底面朝向操作者，透過注制成的微孔載體觀察直線，觀察到直線彎曲或彎折的微孔載體是有氣泡、或者沒有平展的瓊脂塊，屬于不合格的微孔載體，用記號筆在該微孔底部標注，未標注的微孔載體是合格微孔載體。

2.將待測樣品載入微孔載體

將已配備的待檢測的藥物樣品液及測試對照處理樣品液，轉(zhuǎn)至無菌工作臺，用移液槍吸取樣品液10μl，在槍頭不觸及微孔載體面的情況下點放于步驟1制備的合格微孔載體表面的中部，讓其自動在微孔載體面上擴展分散，靜置在無菌工作臺讓藥物樣品液干化，成為載藥微孔載體。

3.將孢子載入微孔載體