[發明專利]一種檢測棘球蚴病的膠體金試紙條及其制備方法

在審

• 申請號: 202010690018.4
• 申請日: 2020-07-17
• 公開（公告）號: CN111796103A
• 公開（公告）日: 2020-10-20
• 發明（設計）人: 韓秀敏;蔡其剛
• 申請（專利權）人: 青海省人民醫院;青海省畜牧獸醫科學院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N33/558;G01N33/532;G01N33/531
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張晉

本發明提供了一種檢測棘球蚴病的膠體金試紙條及其制備方法，本方法以EmAgB3?GGGS?Em18蛋白為抗原，制備了用于AE早期診斷的膠體金免疫試紙條。本試紙條具有良好的敏感性和特異性，對血清的檢測下限可達到10^?6，檢測準確率高，且操作簡便、迅速，結果判斷直觀，便于基層現場使用，為該病的的大規模篩查提供了血清學診斷工具。

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，具體為一種檢測棘球蚴病的膠體金試紙條及其制備方法。

背景技術

泡型棘球蚴?。ˋlveolar echinococcosis, AE）是由多房棘球絳蟲（Echinococcus multilocularis, Em）的續絳期幼蟲感染引起的一種人畜共患寄生性蠕蟲疾病。該病在中國、日本、俄羅斯、中亞和北美部分地區流行嚴重。根治性肝切除手術是目前唯一比較可靠的治療方法。因此，AE早期免疫診斷是降低本病死亡率的關鍵要求。對AE進行早期診斷并采取及時措施，可顯著降低因AE造成的低死亡率。目前，對于該病的診斷，尤其是確診該病，還主要依賴于病原學及影像學診斷。但影像學診斷需要影像學背景知識，操作復雜，卻又不易識別較小和非典型的病灶，尤其又不易與膿腫或腫瘤進行區別當前，基于純化的天然抗原Em2的酶聯免疫吸附試驗（Em2-ELISA）的診斷方法已被世界衛生組織推薦用于AE的血清診斷。

發明內容

本發明為克服現有技術的上述缺陷，提供一種檢測棘球蚴病的膠體金試紙條及其制備方法。

本發明的目的一是提供一種檢測棘球蚴病的膠體金試紙條的制備方法，具體包括如下步驟：

（1）膠體金的制備：利用檸檬酸鈉還原法制備膠體金溶液。在100 mL去離子水中加入1mL 1%的氯金酸（HAuCl₄）溶液，置于恒溫磁力攪拌器上勻速攪拌混勻，開啟加熱至溶液沸騰1 min，迅速加入新配制的1%檸檬酸鈉溶液2.1 mL，繼續攪拌加熱5 min，可見溶液逐漸變為藍黑色，然后紫黑色，再加熱出現紅色，繼續沸煮出現透明的橙紅色，繼續沸煮7~10 min，顏色穩定為酒紅色。用鋁箔紙蓋住瓶口，自然冷卻至室溫，加去離子水定容至 100 mL。倒入棕色瓶，4℃避光保存；

（2）膠體金標記二抗（山羊抗人IgG Fc）及純化：

取1.5 mL膠體金溶液，用0.1 mol/L K₂CO₃溶液調節pH值至6.5，加入15 μg的山羊抗人IgG Fc抗體，混合均勻，攪拌混勻室溫反應40 min。攪拌下加入30 μL 10%的BSA終止，靜置30 min；

純化膠體金標記抗體，首先4℃溫度下5000 rpm離心30 min，棄去由凝聚的膠體金顆粒形成的沉淀。然后 4℃溫度下9000 rpm離心30 min，仔細吸去上清，沉淀物用金標結合物復溶液稀釋至0.15ml，4℃避光保存備用，有效期7天；

（3）金標墊、樣品墊處理：

將玻璃纖維膜浸泡于封閉液中30 min，37~40℃烘干，密封備用。

將樣品墊浸泡于0.01 M pH7.4磷酸緩沖液中30 min，37±2℃烘干，12~18 h，裝袋備用，有效期24個月；

（4）噴金與劃膜

將純化好的山羊抗人IgG Fc-膠體金復合物用噴膜機以2.0 μL/cm均勻的噴在處理過的金標墊上，37℃烘干24 h，裝袋，密封備用。有效期24個月；

將濃度為0.5 mg/mL的EmAgB3-GGGS-Em18重組蛋白為抗原以1.0 μL/cm劃T線，濃度為1mg/mL的人IgG1以1.0 μL/cm劃C線，37℃烘干24 h，待用；

（5）組裝